提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，第一步将小鼠2i/L‑ESCs用N2B27中添加白血病抑制因子（LIF培养液）进行诱导获得只依赖LIF的小鼠胚胎干细胞（L‑ESCs），并鉴定了其多能性。第二步是将小鼠2i/LIF‑ESCs培养体系换成15%胎牛血清中添加白血病抑制因子的培养液(S/L培养液)，培养5天后，再替换成LIF培养液进行培养，高效率得到L‑ESCs。更换S/L培养液的主要目的是为了提高小鼠ESCs的DNA甲基化水平，这样可有效提高LIF依赖性ESCs的重编程效率。本发明专利技术首先诱导了只依赖LIF的小鼠ESCs，并鉴定了其特性；其次利用特定的诱导方法提高了LIF依赖性小鼠ESCs重编程效率，对哺乳动物多能干细胞体外培养提供新思路。

Culture medium of mouse embryonic stem cells and induction culture method of mouse embryonic stem cells to improve DNA methylation

【技术实现步骤摘要】
提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法
本专利技术属于小鼠胚胎干细胞诱导培养液，尤其是涉及一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法。
技术介绍
小鼠胚胎干细胞(Embryonicstemcell，ESCs)是由着床前胚胎分离而来的多能性细胞，在保持多向分化能力的同时，还可以无限地自我更新。在不同培养条件下培养的小鼠ESCs表现出不同的DNA甲基化水平。培养于NAB27中添加PD0325901，CHIR99021和白血病抑制因子（LIF）的小鼠2i/L-ESCs表现出DNA低甲基化水平，而培养于15%胎牛血清中添加白血病抑制因子（LIF）的小鼠S/L-ESCs表现出DNA高甲基化水平。此外，小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化水平在这两种培养液中是可逆的。近年来有学者提出，Mek1/2的长期抑制会通过下调DNA甲基转移酶及其辅因子，损害小鼠ESCs的基因组完整性和DNA甲基化水平，从而影响体内发育潜力。这说明DNA甲基化在小鼠ESCs的多能性维持起重要的作用。因此，揭示DNA甲基化水平对哺乳动物ESCs的多能性维持和分化过程中的作用具有重要的科学意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，可以显著提高LIF依赖性小鼠胚胎干细胞重编程效率。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案包括以下步骤：一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液，每500mlLIF培养液的组成：N2细胞培养添加剂2-3mlB27细胞培养添加剂4-6ml牛血清白蛋白20-30mg非必需氨基酸4-6ml左旋谷氨酰胺4-6mlβ巯基乙醇0.5-2ml青霉素链霉素4-5ml白血病抑制因子LIF500-1500U/ml基础培养液余量所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。优选，每500mlLIF培养液的组成：基础培养液DMEM/F12238.0ml基础培养液Neurobasal238.0mlN2细胞培养添加剂2.5mlB27细胞培养添加剂5.0ml牛血清白蛋白25.0mg非必需氨基酸5.0ml左旋谷氨酰胺5.0mlβ巯基乙醇1.0ml青霉素链霉素5.0ml白血病抑制因子LIF1000U/ml。一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，包括以下步骤：（1）小鼠胚胎干细胞的准备选用N2B27+2i/LIF培养液培养的小鼠胚胎干细胞，即2i/L-ESCs，在37℃、5%CO2浓度状态下2i/L-ESCs呈边缘整齐的三维穹顶式细胞克隆形态；（2）制备高甲基化的小鼠胚胎干细胞将步骤(1)中制备的小鼠胚胎干细胞2i/L-ESCs用S/L培养液，培养5天，再用上述的LIF培养液进行诱导小鼠胚胎干细胞，稳定传代40代以上。所述步骤（2）中，500mlS/L培养液的组成：基础培养液KnockoutDMEM409.0ml胎牛血清75.0ml非必需氨基酸5.0ml左旋谷氨酰胺5.0mlβ巯基乙醇1.0ml青霉素链霉素5.0ml白血病抑制因子LIF1000U/ml。本专利技术的有益效果是：提高DNA甲基化水平可以显著提高LIF依赖性小鼠胚胎干细胞（L-ESCs）的重编程效率。本专利技术简化目前公认的小鼠胚胎干细胞（2i/L-ESCs）培养液成分，并从DNA低甲基化水平提高为DNA甲基化水平较高的小鼠新型胚胎干细胞，即LIF依赖性小鼠胚胎干细胞（L-ESCs）。对小鼠胚胎干细胞体外培养提供新的思路。附图说明图1是本专利技术中的LIF培养液诱导2i/L-ESCs，第3代和第5代用荧光显微镜拍摄的明场和绿色荧光光信号阳性L-ESCs克隆图。图2是本专利技术中的LIF培养液诱导2i/L-ESCs，第25代和第43代用荧光显微镜拍摄的明场和绿色荧光光信号阳性L-ESCs克隆图。图3是本专利技术中的LIF培养液诱导2i/L-ESCs得到的L-ESCs多能性相关蛋白免疫荧光染色图。图4是本专利技术中的LIF培养液诱导2i/L-ESCs得到的L-ESCs的DNA甲基化测序结果图。图5是本专利技术中LIF培养液诱导2i/L-ESCs得到的L-ESCs贡献E13.5天胎儿生殖嵴和嵌合体小鼠图。图6是本专利技术中LIF培养液诱导2i/L-ESCs得到的L-ESCs碱性磷酸酶染色结果图。图7是本专利技术中LIF培养液诱导2i/L-ESCs得到的L-ESCs核型分析图。图8是本专利技术中的LIF培养液诱导2i/L-ESCs和S/L-ESCs，第4天时用流式细胞仪技术分析绿色荧光信号阳性L-ESCs细胞的百分比。图9是本专利技术中的LIF培养液诱导2i/L-ESCs和S/L-ESCs，第8天时用荧光显微进行计算绿色荧光光信号阳性L-ESCs克隆的数量。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：本专利技术诱导方法包括如下关键技术流程：第一步将小鼠2i/L-ESCs用N2B27中添加白血病抑制因子（LIF培养液）进行诱导获得只依赖LIF的小鼠胚胎干细胞（L-ESCs），并鉴定了其多能性。第二步是将小鼠2i/LIF-ESCs培养体系换成15%胎牛血清中添加白血病抑制因子的培养液(S/L培养液)，培养5天后，再替换成LIF培养液进行培养，高效率得到L-ESCs。更换S/L培养液的主要目的是为了提高小鼠ESCs的DNA甲基化水平，这样可有效提高LIF依赖性ESCs的重编程效率（见图1和2）。本专利技术首先诱导了只依赖LIF的小鼠ESCs，并鉴定了其特性；其次利用特定的诱导方法提高了LIF依赖性小鼠ESCs重编程效率，对哺乳动物多能干细胞体外培养提供新思路。具体说明如下：1.小鼠胚胎干细胞的准备本实验材料是选用目前科学界已知的N2B27+2i/LIF培养液（PD0325901，CHIR99021和白血病抑制因子LIF，简称2i/LIF）培养的小鼠胚胎干细胞（2i/L-ESCs），将其在37℃、5%CO2浓度条件下培养，形成边缘整齐、状态良好的三维穹顶式细胞克隆。2.用只添加LIF培养液诱导LIF依赖性小鼠胚胎干细胞将步骤1中准备好的小鼠胚胎干细胞用化学成分明确的LIF培养液进行诱导L-ESCs。传代到第3至5代时，细胞出现凋亡现象，但是少部分GOF/GFP+克隆能够完好的生存下来，并且可以自我更新，见图1。随着传代次数的增加，GOF/GFP+克隆也逐渐增多，由此得到LIF依赖性小鼠胚胎干细胞，见图2。细胞培养液成分如下：500mlESCs培养液（LIF培养液）的组成：N2细胞培养添加剂（购自Gibco，货号：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液，其特征在于，每500ml LIF培养液的组成：/nN2细胞培养添加剂 2-3 ml/nB27细胞培养添加剂 4-6 ml/n牛血清白蛋白 20-30 mg/n非必需氨基酸 4-6 ml/n左旋谷氨酰胺 4-6 ml/nβ巯基乙醇 0.5-2 ml/n青霉素链霉素 4-5 ml/n白血病抑制因子LIF 500-1500 U/ml/n基础培养液 余量/n所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液，其特征在于，每500mlLIF培养液的组成：
N2细胞培养添加剂2-3ml
B27细胞培养添加剂4-6ml
牛血清白蛋白20-30mg
非必需氨基酸4-6ml
左旋谷氨酰胺4-6ml
β巯基乙醇0.5-2ml
青霉素链霉素4-5ml
白血病抑制因子LIF500-1500U/ml
基础培养液余量
所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。


2.根据权利要求1所述提高DNA甲基化的小鼠胚胎干细胞培养液，其特征在于，每500mlLIF培养液的组成：
基础培养液DMEM/F12238.0ml
基础培养液Neurobasal238.0ml
N2细胞培养添加剂2.5ml
B27细胞培养添加剂5.0ml
牛血清白蛋白25.0mg
非必需氨基酸5.0ml
左旋谷氨酰胺5.0ml
β巯基乙醇1.0ml
青霉素链霉素5.0ml<...

【专利技术属性】
技术研发人员：包斯琴，吴宝江，张宝静，李喜和，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙;15