能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂及使用方法技术

本发明专利技术属于蚊虫防治技术领域，公开了一种能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂及使用方法，能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂是球形芽孢杆菌，能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的亚致死剂量为0.0162±0.0014mg/l。本发明专利技术发现亚致死剂量球形芽孢杆菌处理斯氏按蚊四龄幼虫可导致存活蚊虫的传疟能力增强；发现亚致死剂量球形芽孢杆菌可能通过改变蚊肠道菌群组成和下调蚊天然免疫抗疟关键分子的表达导致疟疾传播能力增强。本发明专利技术有助于明确亚致死剂量球形芽孢杆菌的使用对按蚊传疟能力的影响，指导球形芽孢杆菌的合理应用和制定相应对策，为通过媒介防治阻断疟疾传播奠定基础。

Biological insecticides that can enhance the malaria transmission ability of Anopheles stephensi and their application methods

【技术实现步骤摘要】
能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂及使用方法
本专利技术属于蚊虫防治
，尤其涉及一种能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂及使用方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus,Bs)是一种在自然界中广泛分布、形成亚末端膨大孢子囊和球形芽孢的好气芽孢杆菌。作为主要生物杀虫剂之一Bs常用于蚊虫防治，其作用机制是通过Bs在蚊幼虫肠道内产生Mtx和Bin等毒性蛋白而损伤蚊肠上皮细胞。尽管Bs在蚊虫防治中的应用越来越广泛，然而相关应用基础研究还远远不够。比如，在实际应用中经常有使用不规范(如剂量选择不合适)和药效随时间下降而未及时补药等情况，导致对蚊幼虫的杀伤作用减弱，部分蚊虫在用药后存活，这不仅会造成在人为选择压力下加速耐药性的出现，也可能造成存活蚊虫的传病能力改变从而对蚊传疾病的流行带来负面影响。综上所述，现有技术存在的问题是：球形芽孢杆菌的不合理应用可能导致人为Bs亚致死剂量现象的出现和部分蚊虫在用药后存活，由此可能加速耐药性的出现和改变存活蚊虫的传病能力。解决上述技术问题的难度：不同蚊虫对生物杀虫剂Bs的敏感性存在差异，而针对具体蚊种的合理使用剂量缺乏可参考的实验依据，且对不合理使用中出现的亚致死剂量效果造成的后果和相关分子机制认识不足。解决上述技术问题的意义：通过研究明确Bs的合理使用剂量和阐明亚致死剂量Bs对存活蚊虫传病能力的影响及其分子机制，可为蚊虫防治中Bs的科学合理应用提供参考，从而提高蚊幼虫的杀伤率并避免按蚊传病能力增强的风险。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种防治斯氏按蚊中能够导致其传疟能力增强的生物杀虫剂使用方法及其分子机制。本专利技术是这样实现的，一种避免斯氏按蚊亚致死剂量存在和发生实验方法，所述实验方法包括：第一步，Bs对斯氏按蚊四龄幼虫杀伤效果的检测实验条件为：室温28℃左右，相对湿度为80％，每日日光灯照明12h；在6个搪瓷盘中分别加入1L去氯自来水及100条斯氏按蚊四龄幼虫；配制Bs悬浊液，分别加入上述6个搪瓷盘中，使各盘中Bs终浓度呈递增分布，并依次做好标记；加药后每天记录各盘中的幼虫死亡数；每个浓度重复3次试验；利用Probitanalysis生物测定方法，获得Bs杀伤斯氏按蚊四龄幼虫的亚致死剂量0.0162±0.0014mg/l；第二步，亚致死剂量Bs处理后存活的按蚊对传疟能力的影响实验条件同所述第一步，利用亚致死剂量0.0162±0.0014mg/lBs处理1000条斯氏按蚊四龄幼虫，作为Bs组，同时设置不加药的对照组；48h后，收集各组活蛹于碗中，并放入蚊笼内进行饲养；在液氮中取出冻存的约氏疟原虫BY265荧光株，注射入2只KM小鼠的腹腔，3d后进行传代；传代小鼠原虫血症达到8-10％后，可用于饲喂按蚊；3-5天龄按蚊饥饿处理8-12h后，用感染BY265的小鼠进行饲血，饲血时间为1-2小时；饲血后9-11天解剖蚊胃，观察卵囊情况，包括感染疟原虫的蚊虫数及每个蚊胃上的卵囊数；测定发现Bs处理后斯氏按蚊传疟能力增强。第三步，球形芽孢杆菌对斯氏按蚊传疟能力影响的分子机制研究利用亚致死剂量球形芽孢杆菌处理斯氏按蚊四龄幼虫，收集存活按蚊饲养至3天龄成蚊；同时，设同龄未处理按蚊为对照组。进行约氏疟原虫攻击感染(方法同前)。于吸血感染前后不同时间点，提取斯氏按蚊总RNA，反转录合成cDNA，通过转录组测序发现，Bs处理后TEP1、TEP3、TEP13和TEP15均下调。利用Real-timePCR技术对其进行了验证，结果基本一致。本研究结果提示，Bs可能通过下调斯氏按蚊抗疟天然免疫关键分子的表达增强其传疟能力。于吸血感染前后不同时间点，解剖蚊肠道，提取基因组DNA，利用高通量测序技术分析Bs处理组合对照组间蚊肠道菌群的差异。结果发现，Bs处理可明显改变斯氏按蚊肠道菌群组成。本研究结果提示，Bs可能通过改变斯氏按蚊肠道菌群的组成增强其传疟能力。本专利技术的另一目的在于提供一种应用上述实验方法和结果的斯氏按蚊防治方法，所述斯氏按蚊防治方法中的球形芽孢杆菌应避免使用亚致死剂量0.0162±0.0014mg/l。进一步，所述防治斯氏按蚊中导致其传疟能力增强的生物杀虫剂的使用方法具体包括：第一步，在氯自来水中放入斯氏按蚊四龄幼虫；第二步，按照设定的亚致死剂量浓度加入Bs，轻柔混匀；第三步，观察数天并收集存活按蚊幼虫；第四步，随后蚊幼虫进一步蛹化并羽化成成蚊；该存活按蚊成蚊传疟能力可增强。进一步，所述第一步中在1L去氯自来水中放入100条斯氏按蚊四龄幼虫。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术发现亚致死剂量Bs可导致存活的斯氏按蚊传疟能力增强。通过对其机制进行探究，发现Bs可能通过改变蚊肠道菌群组成，下调重要蚊天然免疫抗疟关键分子(如TEP1分子等)导致疟疾传播能力增强。本专利技术有助于明确Bs的应用对按蚊传疟能力的影响，指导Bs的合理应用和制定相应对策，为通过媒介防治消灭疟疾奠定基础。附图说明图1是本专利技术实施例提供的防治斯氏按蚊中导致其传疟能力增强的生物杀虫剂使用方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的亚致死剂量Bs增强斯氏按蚊的传疟能力示意图；图中：A.对照组和Bs处理组斯氏按蚊的约氏疟原虫感染情况；B.对照组和Bs处理组约氏疟原虫的感染度和感染率比较分析；C.对照组和Bs处理组斯氏按蚊蚊胃基底膜上疟原虫卵囊黑化情况；D.对照组和Bs处理组斯氏按蚊蚊胃基底膜上疟原虫卵囊黑化度和黑化率比较分析。图3是本专利技术实施例提供的Bs处理组TEPs表达下调示意图；图中：A.转录组分析中TEPs表达的热图B.TEP1,TEP3,TEP13和TEP15的Real-timePCR定量结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本专利技术实施例提供的能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂为球形芽孢杆菌。菌种球型芽孢杆菌2362株(Bs制剂)由湖北康欣农用药业有限公司生产，效价为650IU/mg。LC50：表示导致50％死亡率的用药浓度剂量。球形芽孢杆菌的浓度剂量在0.0162±0.0014mg/l(亚致死剂量)时可导致半数斯氏按蚊四龄幼虫的死亡。如图1所示，本专利技术实施例提供的防治斯氏按蚊中导致传疟能力增强的生物杀虫剂的使用方法包括以下步骤：S101：在1L去氯自来水中放入100条斯氏按蚊四龄幼虫；S102：按照设定的亚致死剂量浓度加入Bs，轻柔混匀；观察数天并收集存活按蚊幼虫；随后蚊幼虫进一步蛹本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂的使用方法，其特征在于，所述能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂的使用方法包括：/n第一步，球形芽孢杆菌对斯氏按蚊四龄幼虫杀伤效果的检测：/n实验条件为：室温28℃，相对湿度为80％，每日日光灯照明12h；/n在6个搪瓷盘中分别加入1L去氯自来水及100条斯氏按蚊四龄幼虫；/n配制球形芽孢杆菌悬浊液，分别加入上述6个搪瓷盘中，使各盘中球形芽孢杆菌终浓度呈递增分布，并依次做好标记；/n加药后每天记录各盘中的幼虫死亡数；/n每个浓度重复3次试验；/n利用Probit analysis生物测定方法，获得球形芽孢杆菌杀伤斯氏按蚊四龄幼虫的亚致死剂量0.0162±0.0014mg/l；/n第二步，亚致死剂量球形芽孢杆菌处理对存活按蚊传疟能力的影响分析：/n利用亚致死剂量0.0162±0.0014mg/l球形芽孢杆菌处理1000条斯氏按蚊四龄幼虫，作为Bs组，同时设置不加药的对照组；/n48h后，收集各组活蛹于碗中，并放入蚊笼内进行饲养；/n在液氮中取出冻存的约氏疟原虫BY265荧光株，注射入2只昆明小鼠的腹腔，3d后进行传代；/n传代小鼠原虫血症达到8-10％后，用于饲喂按蚊；/n3-5天龄按蚊饥饿处理8-12h后，用感染BY265的小鼠进行饲血，饲血时间为1-2小时；/n饲血后9-11天解剖蚊胃，观察卵囊情况，包括感染疟原虫的蚊虫数及每个蚊胃上的卵囊数；/n第三步，球形芽孢杆菌对斯氏按蚊传疟能力影响的分子机制：/n利用亚致死剂量球形芽孢杆菌处理斯氏按蚊四龄幼虫，收集存活按蚊饲养至3天龄成蚊；同时，设同龄未处理按蚊为对照组；/n进行约氏疟原虫攻击感染；/n于吸血感染前后不同时间点，提取斯氏按蚊总RNA，反转录合成cDNA，通过转录组测序；利用Real-time PCR技术进行验证；/n于吸血感染前后不同时间点，解剖蚊肠道，提取基因组DNA，利用高通量测序技术分析Bs处理组和对照组间蚊肠道菌群的差异。/n...

【技术特征摘要】
1.一种能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂的使用方法，其特征在于，所述能够导致斯氏按蚊传疟能力增强的生物杀虫剂的使用方法包括：
第一步，球形芽孢杆菌对斯氏按蚊四龄幼虫杀伤效果的检测：
实验条件为：室温28℃，相对湿度为80％，每日日光灯照明12h；
在6个搪瓷盘中分别加入1L去氯自来水及100条斯氏按蚊四龄幼虫；
配制球形芽孢杆菌悬浊液，分别加入上述6个搪瓷盘中，使各盘中球形芽孢杆菌终浓度呈递增分布，并依次做好标记；
加药后每天记录各盘中的幼虫死亡数；
每个浓度重复3次试验；
利用Probitanalysis生物测定方法，获得球形芽孢杆菌杀伤斯氏按蚊四龄幼虫的亚致死剂量0.0162±0.0014mg/l；
第二步，亚致死剂量球形芽孢杆菌处理对存活按蚊传疟能力的影响分析：
利用亚致死剂量0.0162±0.0014mg/l球形芽孢杆菌处理1000条斯氏按蚊四龄幼虫，作为Bs组，同时设置不加药的对照组；
48h后，收集各组活蛹于碗中，并放入蚊笼内进行饲养；
在液氮中取出冻存的约氏疟原虫BY265荧光株，注射入2只昆明小鼠的腹腔，3d后进行传代；
传代小鼠原虫血症达到8-10％后，用于饲喂按蚊；
3-5天龄按蚊饥饿处理8-12h后，用感染BY265的小鼠进行饲血，饲血时间为1-2小时；
饲血后9-11天解剖蚊胃，观察卵囊情况，包括感染疟原虫的蚊虫数及每个蚊胃上...

【专利技术属性】
技术研发人员：王英，于莎莎，秦杰，王盼，张艳玲，郑鸿，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50