用于裂解玉米赤霉烯酮的手段和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于增加α/β‑水解酶的稳定性的方法。另外，本发明专利技术还涉及一种通过本发明专利技术的方法能够获得的α/β‑水解酶。本发明专利技术还提供具有降低的总平均亲水性(GRAVY)值和/或包含特定突变的α/β‑水解酶。此外，本发明专利技术涉及本发明专利技术的α/β‑水解酶用于降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的用途。

Methods and methods for cracking zearalenone

【技术实现步骤摘要】
用于裂解玉米赤霉烯酮的手段和方法
本专利技术涉及一种用于增加α/β-水解酶的稳定性的方法。另外，本专利技术涉及一种通过本专利技术的方法能够获得的α/β-水解酶。本专利技术还提供具有降低的总平均亲水性(GRAVY)值和/或包含特定突变的α/β-水解酶。此外，本专利技术涉及本专利技术的α/β-水解酶用于降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的用途。
技术介绍
真菌毒素是丝状真菌产生的次生代谢物。真菌毒素的一个重要代表是由许多镰孢菌真菌产生并在世界各地均可发现的玉米赤霉烯酮(ZEN)(以前称为F-2毒素)。这些真菌尤其侵染栽培植物，例如各种各样的谷类，其中真菌侵染通常出现在收获之前，这时真菌生长和/或真菌毒素产生可以在贮藏之前或甚至收获之后发生，即贮藏之前或不适当的贮藏条件下发生。联合国粮农组织(FAO)估计，在世界范围内25％的农产品被真菌毒素污染，这导致巨大的经济损失。在一项跨越8年的国际研究中，从2004年1月至2011年12月分析了总共19,757个样品，其中72％样品经测试呈至少一种真菌毒素阳性，发现39％样品被污染，和37％样品经测试呈ZEN阳性(Schatzmayr和Streit(2013)‘Globaloccurrenceofmycotoxinsinthefoodandfeedchain:Factsandfigures.’WorldMycotoxinJournal6(3):213-222)。在世界的所有地区中，并且在经测试的所有类别的谷物和饲料作物，例如玉米、大豆粉、小麦、麦麸、DDGS(含有可溶物的干酒糟)中，以及在成品动物饲料混合物中，以高至100％的发生率发现了ZEN。ZEN与雌激素受体结合并且可以引起激素紊乱，在经口摄取后被立即吸收，并且被哺乳动物转变为两个立体异构的代谢物，分别为α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)和/或β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL)。例如，α-ZEL以及α-玉米赤霉醇(α-ZAL)和/或玉米赤霉酮(ZAN)具有比ZEN更强的雌激素效应。尽管缀合的ZEN衍生物具有比ZEN本身低的雌激素活性，然而在消化道中自这些缀合的ZEN衍生物可以再次释放ZEN，从而恢复其完全的雌激素活性。ZEN具有高达20,000mg/kg体重的口服LD50，在长期暴露的动物或人中可出现亚急性和/或亚慢性的毒性作用，例如致畸、致癌、雌激素和免疫抑制效应。被ZEN污染的饲料导致哺乳动物中的发育障碍。其中猪，特别是仔猪对ZEN是极其敏感的。在饲料中超过0.5ppm的ZEN浓度导致发育障碍，超过1.5ppm的浓度可以导致猪中的超雌激素性。在牛中，12ppmZEN浓度可引起自然流产。由于通过粘膜，特别是通过胃粘膜以及口腔粘膜ZEN被迅速吸收，因此立即的且定量的灭活是必要的。在口服给药ZEN后30分钟就已经可以在血液中检测到。由于ZEN的有害效应，欧盟具有对食品中的ZEN的法定上限以及对在饲料中的ZEN上限的推荐(ECNo.1881/2006)。用于减少食品和饲料产品的ZEN污染的最初策略是限制真菌生长，例如通过遵循“良好的农业规范”。这尤其包括确保种子没有害虫和真菌侵染，或者确保及时从田间移除农业废弃物。此外，还可以通过使用杀真菌剂来减少田间的真菌生长。收获之后，收获的物料应当以低于15％的残留水分并在低温下贮藏，以防止真菌生长。同样地，在进一步加工之前应当去除被真菌侵染污染的物料。尽管有这一系列的预防性措施，即使在拥有最高农业标准的地区(比如北美和中欧)，在2004年至2011年，仍然发现有高达37％的测试玉米样品被ZEN污染(Schatzmayr和Streit(2013))。
技术实现思路
为了克服上述问题和缺陷，需要开发另一种α/β-水解酶，该种α/β-水解酶能够解除ZEN的毒性且适用于用作食品或饲料添加剂或食品或饲料产品。在以下描述了、在实施例中说明了、在附图中示出了并在权利要求中反映了本专利技术的方案。本专利技术涉及一种用于增加α/β-水解酶的稳定性的方法，所述α/β-水解酶包含对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列，或包含与对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列具有58％或更高的序列同一性的序列(CAP-结构域；与SEQIDNO:1的CAP-结构域有58％的同一性)，所述方法包括：在以下位置处置换至少一个氨基酸：-对应于SEQIDNO:1的位置160至205的位置，或-对应于SEQIDNO:2的位置159至204的位置，或-对应于SEQIDNO:3、4或5的位置160至205的位置，或-对应于SEQIDNO:6的位置176至222的位置，其中，采用这样的氨基酸置换所述氨基酸：所采用的氨基酸具有比被置换的氨基酸更负的亲水指数，其中所述亲水指数由Kyte和Doolittle亲水指数确定，由此获得具有增加的稳定性的α/β-水解酶。此外，本专利技术涉及一种通过本专利技术的方法能够获得的α/β-水解酶。本专利技术还提供一种具有多肽序列的α/β-水解酶，所述多肽序列包含对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列，或包含与对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列具有大于58％的序列同一性的序列，其中，所述多肽序列包含在以下位置处的至少一个氨基酸置换：-对应于SEQIDNO:1的位置160至205的位置，或-对应于SEQIDNO:2的位置159至204的位置，或-对应于SEQIDNO:3、4或5的位置160至205的位置，或-对应于SEQIDNO:6的位置176至222的位置，其中，所述α/β-水解酶具有的总平均亲水性(GRAVY)值与具有SEQIDNO:1的多肽序列的α/β-水解酶的GRAVY值相比负至少0.6％。本专利技术还涉及一种具有多肽序列的α/β-水解酶，所述多肽序列包含对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列，或包含与对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列具有大于58％的序列同一性的序列，其中，所述多肽序列包含在以下位置处的至少一个氨基酸置换：-对应于SEQIDNO:1的位置185至191的位置，或-对应于SEQIDNO:2的位置184至190的位置，或-对应于SEQIDNO:3、4或5的位置185至191的位置，或-对应于SEQIDNO:6的位置201至208的位置，其中，所述氨基酸置换选自V→A、G→R、G→S、A→P、A→R、A→D、A→H、A→N、A→G、S→D、P→H、M→D、G→E、I→A、I→V、H→N和Q→K，和/或其中采用选自P、R、D、H、G或N的氨基酸置换所述氨基酸，优选地，所采用的氨基酸选自R、D、H、G或N，更优选地，所采用的氨基酸选自R或N。本专利技术还涉及一种具有多肽序列的α/β-水解酶，所述多肽序列包含对应于SEQIDNO:6的位置161至235的序列，或包含与对应于SEQIDNO:6的位置161至235的序列具有大于58％的序列同一性的序列，其中，所述多肽序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于增加α/β-水解酶的稳定性的方法，所述α/β-水解酶包含对应于SEQ ID NO:1的位置145至218的序列，或包含与对应于SEQ ID NO:1的位置145至218的序列具有58％或更高的序列同一性的序列，所述方法包括：/n在以下位置处置换至少一个氨基酸：/n-对应于SEQ ID NO:1的位置160至205的位置，或/n-对应于SEQ ID NO:2的位置159至204的位置，或/n-对应于SEQ ID NO:3、4或5的位置160至205的位置，或/n-对应于SEQ ID NO:6的位置176至222的位置，/n其中，采用这样的氨基酸置换所述氨基酸：所采用的氨基酸具有比被置换的氨基酸更负的亲水指数，/n其中所述亲水指数由Kyte和Doolittle亲水指数确定，/n由此获得具有增加的稳定性的α/β-水解酶。/n

【技术特征摘要】
20180731 EP EP1818653201.一种用于增加α/β-水解酶的稳定性的方法，所述α/β-水解酶包含对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列，或包含与对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列具有58％或更高的序列同一性的序列，所述方法包括：
在以下位置处置换至少一个氨基酸：
-对应于SEQIDNO:1的位置160至205的位置，或
-对应于SEQIDNO:2的位置159至204的位置，或
-对应于SEQIDNO:3、4或5的位置160至205的位置，或
-对应于SEQIDNO:6的位置176至222的位置，
其中，采用这样的氨基酸置换所述氨基酸：所采用的氨基酸具有比被置换的氨基酸更负的亲水指数，
其中所述亲水指数由Kyte和Doolittle亲水指数确定，
由此获得具有增加的稳定性的α/β-水解酶。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在以下位置处置换至少一个氨基酸：
-对应于SEQIDNO:1的位置185至191的位置，和/或
-对应于SEQIDNO:2的位置184至190的位置，和/或
-对应于SEQIDNO:3、4或5的位置185至191的位置，和/或
-对应于SEQIDNO:6的位置201至208的位置。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中采用选自R、K、N、Q、D、E、H、P、Y、W、S、T、G、A、M、C、F、L或V的氨基酸置换所述氨基酸，优选地，所采用的氨基酸选自R、K、N、Q、D、E、H、P、Y、W、S、T或G，更优选地选自R、K、N、Q、D、E、H或P。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中采用选自R、D、H、G、N或P，优选地选自R、D、H、G或N的氨基酸置换所述氨基酸，更优选地，所采用的氨基酸选自R或N。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述氨基酸置换选自以下的一个或多个：V→A、G→R、G→S、A→P、A→R、A→D、A→H、A→N、A→G、S→D、P→H、M→D、G→E、I→A、I→V、H→N、Q→K、F→Y和/或V→C，优选地，所述氨基酸置换选自以下的一个或多个：V160A、G185R、G185S、A186P、A186R、A188D、A188H、A188N、A188G、A188R、S189D、P190H、M191D、G199E、I200A、I200V、H203N、Q205K、F183Y和/或V197C，更优选地，所述氨基酸置换选自G185R、A186R、A188R、A188D、A188H、A188N和/或M191D。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述增加的稳定性为GRAVY值的降低，pH稳定性的增加和/或温度稳定性的增加。


7.一种通过权利要求4、5或6中任一项所述的方法能够获得的α/β-水解酶。


8.一种具有多肽序列的α/β-水解酶，所述多肽序列包含对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列，或包含与对应于SEQIDNO:1的位置145至218的序列具有大于58％的序列同一性的序列，
其中，所述多肽序列包含在以下位置处的至少一个氨基酸置换：
-对应于SEQIDNO:1的位置160至205的位置，或
-对应于SEQIDNO:2的位置159至204的位置，或
-对应于SEQIDNO:3、4或5的位置160至205的位置，或
-对应于SEQIDNO:6的位置176至222的位置，
其中，所述α/β-水解酶具有的GRAVY值与具有SEQIDNO:1的多肽序列的α/β-水解酶的GRAVY值相比负至少0.6％...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·萨姆海塞尔，S·弗鲁豪夫，W·D·摩尔，A·霍巴特纳，G·沙特兹迈尔，E·M·宾德，M·阿莱希科，M·费菲尔，
申请(专利权)人：奥地利商艾尔柏有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT