一种A21978C高产菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种A21978C的高产菌株，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.16016。本发明专利技术还公开了所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016用于生产达托霉素的应用。所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016，经发酵培养后，A21978C的产量可达到3.47g/L左右，是高产A21978C的优良菌株，具有广泛的工业应用前景。

A21978c high yield strain and its application

【技术实现步骤摘要】
一种A21978C高产菌株及其应用
本专利技术属于生物工程的
，具体的说，是关于一种A21978C高产菌株及其应用。
技术介绍
达托霉素是治疗革兰氏阳性菌感染、特别是耐药菌感染的重磅炸弹药物，临床应用于革兰氏阳性菌引起的皮肤感染和MRSA引起的心内膜炎。达托霉素是从链霉菌产生的脂肽类次级代谢产物A21978C混合物中分离出的最小的组分。A21978C混合物均含有一个13个氨基酸组成的母核，包含了环上10个氨基酸和环外的三个氨基酸残基。不同的是达托霉素在结构上含有一个直链癸酸侧链，其他三个主组分在N末端分别含有11、12、13个碳原子的支链脂肪酸链。利用产A21978C的菌株在发酵罐上补加癸酸后可以实现大规模工业化生产达托霉素。由于发酵单位低，达托霉素工业化生产难度大、成本高，从而导致其价格昂贵、产量远远不能满足市场需求。目前国内外应用的菌株，其达托霉素产量约在2.0g/L至3.0g/L之间。中国专利文献CN102796680B公开了通过补加癸酸和癸醛组合物作为前体，发酵玫瑰孢链霉菌生产达托霉素，其效价为2.55g/L。专利文献CN106133131A公开了通过诱变获得丝状链霉菌(streptomycesfilamentosus)突变株，其罐发酵生产达托霉素的能力为2.75g/L。
技术实现思路
为了克服现有技术中的不足，本专利技术旨在提供一种A21978C高产菌株。为此，本申请以小链霉菌(Streptomycesparvus)CGMCCNo.4027为出发菌株，经基因工程和诱变育种，筛选到一株A21978C高产菌株，并将其进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.16016。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种A21978C高产菌株，其保藏号为CGMCCNo.16016。作为本专利技术的第二个方面，所述的A21978C高产菌株CGMCCNo.16016用于生产达托霉素的应用。作为本专利技术的第三个方面，一种达托霉素的生产方法，通过发酵上述所述的A21978C高产菌株CGMCCNo.16016获得A21978C，再通过补加癸酸获得达托霉素。根据本专利技术，所述发酵的条件如下：发酵培养基(wt)：玉米淀粉0.5％，葡萄糖0.8％，糊精3.2％，黄豆饼粉2.5％，(NH4)2SO40.5％，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.06％，MnSO40.02％，pH7.5；发酵培养条件：28℃，通气量1vvm，搅拌转速150～400rpm，罐压0.05mpa；DO保持20％以上，pH用氨水控制在6.5；自发酵培养20h开始补加50％癸酸溶液，补加速率为0.15ml/L·h，每培养36h，前体补加速率增加0.1ml/L·h，至约200h发酵结束。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的A21978C高产菌株，其遗传性状稳定，具有良好的工业化应用价值。本专利技术的A21978C高产菌株，经过发酵获得的发酵液中的A21978C的含量可达到3.47g/L左右，是高产A21978C的优良菌株。附图说明图1为出发菌株和突变菌株的色谱图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。本申请以StreptomycesparvusCGMCCNo.4027为出发菌株，经基因工程和紫外诱变，获得一株A21978C高产菌株，并将其进行了保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为小链霉菌Streptomycesparvus，保藏号为CGMCCNo.16016，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年06月28日。1、以下实施例所用的试验材料，具体详见表1。表1试验材料试验材料来源pMD19-Tsimple载体Takara公司pKC1139载体生物风公司E.coliET12567/pUZ8002生物风公司armB基因NCBI登录号JQ911524.12、以下实施例所用到的引物，具体如表2所示。表2本专利技术的引物引物名称引物序列SEQIDarb-up-FAAAAGCTTACGGTCTTGTGGCGGAAGANO：1arb-up-RGCTGTTCGAGGCACAGGCGTCTAGAGGTGACGTACGCAACCTGCNO：2arb-down-FGCAGGTTGCGTACGTCACCTCTAGACGCCTGTGCCTCGAACAGCNO：3arb-down-RGGGAATTCAGGAGGGCCGGGTCCTGTCNO：4arb-v-FACGGCAACCCGGTACCCCANO：5arb-v-RGCACCCCTTTCCCGACACGNO：6实施例1基因工程菌的构建以CGMCCNo.4027总DNA为模板，利用引物arb-up-F/R和arb-down-F/R分别扩增armB基因的上下游同源臂片段，两片段重叠PCR拼接，克隆到pMD19-Tsimple载体上，获得质粒pLYARB。pLYARB经HindIII和EcoRI双酶切，回收同源臂片段，然后与经过同样双酶切的pKC1139载体连接，获得用于敲除armB基因的重组质粒pKCARB。将质粒pKCARB电转入E.coliET12567/pUZ8002感受态，然后接合转移入CGMCCNo.4027中，涂布于MS平板(组成为：黄豆饼粉2.0％，甘露醇2.0％，琼脂粉2.0％，pH自然。)，28℃培养18h后覆盖安普霉素和萘啶酮酸溶液继续培养；挑取接合子在含有安普霉素抗性的MS培养基37℃培养，获得单交换菌株；获得的单交换菌株经过连续传代后通过影印法挑取对安普霉素敏感的菌株；利用引物arb-v-F/R进行筛选，其中，回复突变株PCR片段长2.4kb，敲除突变株PCR片段长0.6kb，后者缺失了部分armB基因序列；获得的ΔarmB敲除突变株记作LYARB。实施例2紫外诱变及突变株筛选用0.9％的生理盐水收集LYARB孢子，28℃、220rpm震荡20min，经灭菌脱脂棉过滤，制得单孢子悬液，血球计数板计数，用生理盐水调整到孢子浓度为108个/mL。取5mL上述制备的孢子悬液置于直径6cm的无菌培养皿中，开盖置于15W紫外灯下30cm处照射，恒速搅拌。照射20s后，经过适当稀释，涂布于含有10μg/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A21978C高产菌株，其特征在于，所述的A21978C高产菌株的保藏号为CGMCCNo.16016。/n

【技术特征摘要】
1.一种A21978C高产菌株，其特征在于，所述的A21978C高产菌株的保藏号为CGMCCNo.16016。


2.如权利要求1所述的A21978C高产菌株CGMCCNo.16016用于生产达托霉素的应用。


3.一种达托霉素的生产方法，其特征在于，通过发酵权利要求1所述的A21978C高产菌株CGMCCNo.16016获得A21978C，再通过补加癸酸获得达托霉素。


4.如权利要求3所述的达托霉素的生产方法，其特征在于，所述发酵的...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏维，戈梅，夏兴，蒋美珍，金文翔，靳旭，吴伟燕，
申请(专利权)人：上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31