一种重组转座酶及其用途制造技术

本发明专利技术公开一种重组转座酶，重组转座酶含有Tgf2序列与SV40NLS序列，Tgf2序列位于SV40NLS序列的上游，该重组转座酶能够高效地定位在斑马鱼的细胞核当中，显著地提升了转座酶的活性与效率。

A recombinant transposase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种重组转座酶及其用途
本专利技术属于水产科学领域，涉及Tgf2转座元件的应用，特别涉及一种金鱼Tgf2转座元件的插入诱变研究。
技术介绍
转座子，在基因组上能够自由跳跃(复制或者移位)的一类DNA片段，其移动的过程被称为转座。由Clintock,B.M于1950年第一次在玉米染色体中获得，且命名称之为“转座元件”(Transposableelements)。它的发现改观了大家对于基因组序列保持稳定性这一长久的看法，同时破除了遗传物质在染色体上位置固定这一理论。此后研究学者们证实了转座系统广泛存于自然界的许多领域，包括细菌、真菌及昆虫等在内的多种生物，转座子系统的研究已经成为了生物基因分析的重要工具。运用转座子元件独有的转座特性，可以把标记过的转座子元件插入到目的基因或基因组中，随之形成了转座子标签、转座子定点杂交、转座子基因打靶等技术。运用以上这些技术，就能够探索基因组的功能、组间功能差异，使目的基因活性发生变化，获取转基因生物，能够加快基因整合，实现基因治疗等。作为基因工具，目前研究较热门的转座子基因来源于四个转座子产家族：Tcl/mariner、hAT、PIF/Harbinger和piggyBac(PB)转座子家族[1]。尽管自然界中转座子分布广泛，但长期的进化过程使得大多数的哺乳动物和鸟类转座子基因组中，由于转座酶的逐渐失活致使转座活性丧失，从而导致我们对脊椎动物转座子的开发应用一直处于缓慢发展时期[2-3]。直到Koga等人在青鳉鱼基因组中发现了具备自主转座活性的Tol2转座子，引发了整个学术界对转座子的研究热情。Tol2转座子属于天然存在的脊椎动物转座子[4]，它的发现促进了转座子在脊椎动物中的应用研究。hAT转座子家族，是天然存在具有自主转座活性的超家族，包括在玉米中的Ac/Ds转座体系，在鱼类中发现的Tol2转座子。金鱼Tgf2(GenBank:HM146132)转座子元件是由邹曙明教授实验室于19种不同鱼类中筛选获得，是一个具有自主活性的DNA转座子，隶属于hAT转座子家族。其全长4720bp，具有4个ORF，能够编码全长为686个氨基酸长度的转座酶蛋白。金鱼Tgf2转座子具有hAT转座子家族的特性，其中间位点的反向重复序列可以形成一种有别于Tol2转座子的“十”字结构，其与Tgf2的转座活性有关[5]。我们知道，所有借助于被动运输和主动运输进出细胞核的物质都是经由核膜上的核孔复合物(nuclearporecomplex,NPC)发生的。NPC的结构和功能似乎在所有真核生物中都是保守的，表明它在真核细胞功能中的中心作用。顾名思义，NPC具有孔状分子筛的功能，即分子量小于40-45kDa的分子可以自由扩散进出细胞核。大于45kDa的蛋白质需要核定位信号(Nuclearlocalizationsignal,NLS)帮助其转运进入细胞核。低氧诱导因子(HIFs)是由一个在进化上保守的转录调节家族组成，该家族在低氧张力下能够进行稳态反应，且在协调细胞对低氧反应的过程中发挥着关键作用[6]。HIFs是由不稳定的α亚基(1α,2α,or3α)和一个组成型HIFβ亚基一起形成的异源二聚体复合物[6-8]。常氧条件下，HIFs的ODD结构域内的O2在脯氨酸残基位点上在脯氨酸羟化酶(hydroxylatedbyprolinehydroxylase,PHD)的作用下发生羟基化，然后与E3泛素连接酶蛋白(vonHippel-Lindauprotein,pVHL)结合靶向蛋白酶体进行降解。低氧条件下，HIFs由于的降解途径被抑制，从而聚集而转运至细胞核内，与β亚基结合为功能性转录复合物，进而调节低氧相关基因表达。在常氧条件下，C-TAD(terminaltransactivationdomain,TAD)结构域中的保守天冬酰胺残基受到抑制因子HIF-1(factorinhibitingHIF-1,FIH)的作用而发生羟基化。缺氧时，由于羟基化效率降低降低，使HIF1α和HIF2α蛋白维持稳定状态。它们随后与HIFβ亚基形成异源二聚物，转运进入细胞核，募集诸如P300/CBP之类的共激活因子，并结合靶基因启动子区域中的缺氧应答元件。HIFs的结构和功能对于解释低氧反应的分子机制非常重要，然而目前与HIF1α和HIF2α的深入研究相比，我们对HIF3α的研究还很有限，尤其是在鱼类低氧反应中的研究更是知之甚少。参考文献：[1]NiJ,ClarkKJ,FahrenkrugSC,etal.Transposontoolshoppinginvertebrates[J].BriefingsinFunctionalGenomics&Proteomics,2008,7(6):44-453.[2]LargaespadaDA,Generatingandmanipulatingtransgenicanimalsusingtransposableelements[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2003,1(1):1-10.[3]KempkenF,WindhoferF,ThehATfamily:aversatiletransposongroupcommontoplants,fungi,animals,andman[J]2001,110(1):1-9.[4]KogaA,SuzukiM,InagakiH,etal.Transposableelementinfish[J].Nature,1996,383(6595):30.[5]邹曙明,杜雪地,袁剑等.金鱼hAT家族转座子Tgf2的克隆及其结构[J].遗传,2010,32(12):1263-1268.[6]NathB,SzaboG.Hypoxiaandhypoxiainduciblefactors:diverserolesinliverdiseases[J].Hepatology,2012,55:622-633.[7]Semenza,G.L.,1999.RegulationofmammalianO2homeostasisbyhypoxia-induciblefactor1[J].AnnualReviewofCellandDevelopmentalBiology,199915:551-578.[8]Semenza,GL.HIF-1:mediatorofphysiologicalandpathophysiologicalresponsestohypoxia[J].JournalofAppliedPhysiology,2000,88:1474-1480.[9]刘琳,张美丽,黄粤.DNA转座子在小鼠基因功能研究中的应用[J].遗传,2011,33(5):485-493.[10]LampeDJ,ChurchillME,RobertsonHM.Apurifiedmarinertransposaseissufficienttomediatetranspositi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组转座酶，所述重组转座酶的蛋白序列包括Tgf2蛋白序列与NLS蛋白序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组转座酶，所述重组转座酶的蛋白序列包括Tgf2蛋白序列与NLS蛋白序列。


2.如权利要求1所述重组转座酶，所述Tgf2蛋白序列的编码序列的GenBank号为：HM146132。


3.如权利要求1所述重组转座酶，所述NLS蛋白序列为SV40NLS蛋白序列。


4.如权利要求1所述重组转座酶，所述Tgf2蛋白序列位于所述NLS蛋白序列的上游。


5.如权利要求1所述重组转座酶，所述Tgf2蛋白序如SEQIDNO.1所示；所述NLS蛋白序列如SEQIDNO.2所示。


6.一种重组转座酶基因，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹曙明，刘子茵，郑国栋，陈杰，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31