一种抗甲氰菊酯单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种抗甲氰菊酯单克隆抗体及其制备方法与应用；一种抗甲氰菊酯单克隆抗体其抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；与现有技术相比，本发明专利技术的优点是：1)抗体性能突出；与其他拟除虫菊酯类杀虫剂的交叉反应可忽略不计；检测限(IC10，LOD)为0.4ng/mL，优于目前已报道的甲氰菊酯抗体；2)试纸条特异、灵敏、简便、快速；无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在5至10分钟内即可判定检测结果；3)结果显示形象、直观、准确：4)节省费用，适用范围广，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。

A monoclonal antibody against fenpropathrin and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种抗甲氰菊酯单克隆抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及农药残留免疫分析
，具体涉及一种抗甲氰菊酯单克隆抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
甲氰菊酯(Fenpropathrin)是一种拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，中等毒性，具有触杀、胃毒和一定的驱避作用，无内吸、熏蒸作用。其属神经毒剂，作用于昆虫的神经系统，使昆虫过度兴奋、麻痹而死亡。该药适用作物非常广泛，常使用于苹果、柑橘、荔枝、桃树、栗树等果树及棉花、茶树、十字花科蔬菜、瓜果类蔬菜、花卉等植物，主要用于防治叶螨类、瘿螨类、菜青虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫、红铃虫、茶尺蠖、小绿叶蝉、潜叶蛾、食心虫、卷升蛾、蚜虫、白粉虱、蓟马及盲椿类等多种害虫、害螨。目前，甲氰菊酯的检测方法主要是仪器分析方法，包括气相色谱法(Gaschromatography，GC)和气相色谱串联质谱法(GC-MS)等。然而，这一类仪器检测方法通常需要贵重的仪器设备，并只能在实验室中进行。与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。ELISA(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在甲氰菊酯的快速检测上的应用受到很大的限制。胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。但是，目前已报道的甲氰菊酯的单克隆抗体的特异性不强，基于该抗体制备的胶体金试纸条在试剂应用中应产生假阳性。
技术实现思路
本专利技术目的是：提供一种抗甲氰菊酯单克隆抗体及其制备方法与应用。本专利技术的技术方案是：一种抗甲氰菊酯单克隆抗体，其抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了一种抗甲氰菊酯单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)由免疫半抗原偶联BSA制备得到免疫原；(2)用免疫原免疫BALB/c小鼠，并选择所得效价最高的小鼠脾脏细胞；(3)将骨髓瘤细胞SP2/0与所述(2)中所得效价最高的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备得到杂交瘤细胞；(4)通过筛选和亚克隆得到能稳定分泌抗甲氰菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再将该杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水；(5)采用ProteinA纯化小鼠腹水，得到抗甲氰菊酯单克隆抗体。进一步的：所述(1)中免疫半抗原偶联BSA的分子式为。进一步的：所述免疫原的免疫剂量为100μg/只，共免疫5次；首次免疫由等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，之后用等体积免疫抗原和弗氏不完全佐剂乳化；从第三次免疫开始，每次免疫后尾静脉采血，测定效价。进一步的：所述效价最高的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0的比例为10：1。另外，本专利技术还涉及一种基于上述技术方案的的抗甲氰菊酯单克隆抗体在胶体金试纸上的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点是：1)抗体性能突出：本专利技术提供的甲氰菊酯单克隆抗体特异性识别甲氰菊酯，与其他拟除虫菊酯类杀虫剂的交叉反应可忽略不计；利用本专利技术提供的抗甲氰菊酯抗体实现的竞争ELISA的抑制中浓度(IC50)为4.5ng/mL，检测限(IC10，LOD)为0.4ng/mL，优于目前已报道的甲氰菊酯抗体。2)试纸条特异、灵敏、简便、快速：胶体金试纸条很好的保留了单克隆抗体的特性，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量为5ng/mL；无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在5至10分钟内即可判定检测结果。3)结果显示形象、直观、准确：胶体金试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况来判断，结果判定形象、直观、准确、简单明了。4)节省费用，适用范围广，便于推广：使用胶体金试纸条进行检测，比使用仪器和ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低；试纸条的使用范围广，可满足不同层次人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。附图说明下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：图1为本专利技术中甲氰菊酯胶体金检测试纸条俯瞰结构示意图；图2未本专利技术中甲氰菊酯胶体金测试纸条剖面结构示意图；其中：1、衬板；2、样品垫；3、金标结合物垫；4、纤维素膜；5、检测线；6、对照线；7、吸水垫；8-1、样品浸入端保护膜；8-2、手柄端保护膜；9、标识线；图3为本专利技术中甲氰菊酯胶体金检测试纸条结果判定示意图；图中，A为阴性样品检测结果，B为弱阳性样品检测结果，C为强阳性样品检测结果，D和E为试纸条失效。具体实施方式实施例：1、甲氰菊酯半抗原的合成氰基[3-(4-硝基苯氧基)苯基]甲基-2,2,3,3-四甲基环丙烷羧酸酯的合成。2mmol3-(4-硝基苯氧基)苯甲醛溶解在2mL预冷的二氯甲烷中，一次性搅拌加入冰浴的2mL含有2mmol2,2,3,3-四甲基环丙烷甲酰氯的二氯甲烷，立即加入0.18mL吡啶，并搅拌。缓慢升到室温后搅拌反应2h。使用3NHCl酸化后，用水洗两次，通过3g硅胶过滤，25mL二氯甲烷洗脱后去除邮寄溶剂，获得黄色油状物。氰基[3-(4-氨基苯氧基)苯基]甲基-2,2,3,3-四甲基环丙烷羧酸酯的合成。将0.75mmol氰基[3-(4-硝基苯氧基)苯基]甲基-2,2,3,3-四甲基环丙烷羧酸酯溶解在3mL乙醇，搅拌加入3.7mmol氯化锡。70℃反应35min，加入10mL含有0.7g硅藻土和0.72gKHCO3的水。过滤后用乙酸乙酯萃取固体，去除有机溶剂后得到红色胶状物。经硅胶纯化后得到黄色胶状物。2、甲氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联将0.1mmol半抗原溶解在1mL1MHCl溶液中，冰浴搅拌下加入0.5mLNaNO2水溶液(14mg/mL)。加入0.3mLDMF后搅拌10min。将溶液平均分成两份(大约0.9mL)，分别加入到20mL含有KLH(免疫原，131mg)和BSA(包被原，103mg)的冰浴遇冷的硼酸缓冲液(0.2M,pH8.9)中，冰浴条件下搅拌反应30min。反应结束后使用1M的NaOH将溶液(黄色)的pH值调至7.0。加入等体积(20.9mL)冰浴预冷的丙酮，3000g离心10min。使用5mL冰浴预冷的丙酮对沉淀物洗3次。沉淀物溶解在10mL水中，储存在-20℃。3、抗甲氰菊酯单克隆抗体的制备以100μg每只的抗原量免疫6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠。每次间隔时间为2～3周，最后一次超强免疫后3天，无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以10：1的细胞数量用PEG介导的方法融合。融合后置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养至细胞长满培养孔1/3～1/2时，用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗甲氰菊酯单克隆抗体，其特征在于：其抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗甲氰菊酯单克隆抗体，其特征在于：其抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种抗甲氰菊酯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)由免疫半抗原偶联BSA制备得到免疫原；
(2)用免疫原免疫BALB/c小鼠，并选择所得效价最高的小鼠脾脏细胞；
(3)将骨髓瘤细胞SP2/0与所述(2)中所得效价最高的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备得到杂交瘤细胞；
(4)通过筛选和亚克隆得到能稳定分泌抗甲氰菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再将该杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水；
(5)采用ProteinA纯化小鼠腹水，得到抗甲氰菊酯单克隆抗体。

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【专利技术属性】
技术研发人员：盛相国，
申请(专利权)人：苏州快捷康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32