一组与烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力能快速起效的眼镜蛇神经毒素分子在镇痛上的应用制造技术

眼镜蛇神经毒素由于能和神经触突后烟碱乙酰胆碱受体结合阻断神经触突离子流而起到镇痛作用，但目前市场上此类产品需2小时才能起效且疗效不稳定，故无法满足临床需求。这是因为神经毒素需通过血脑屏障在大脑中枢才能起到镇痛作用，而市场上的产品无明确组分，包含各种大小分子量蛋白，故透过血脑屏障速度慢；同时它们和烟碱乙酰胆碱受体的亲和力也不一致。本发明专利技术筛选出一组和烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力的神经毒素分子单体，能迅速通过血脑屏障，30分钟起效镇痛且疗效稳定。神经毒素分子单体克服了混合物无法具体说明究竟是哪一种神经毒素，无蛋白质一级结构；无法精确控制质量的缺陷，使质量控制，临床安全性及有效性都得到了更好的保证。

Application of a group of cobra neurotoxin molecules with high affinity to nicotinic acetylcholine receptor in analgesia

【技术实现步骤摘要】
一组与烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力能快速起效的眼镜蛇神经毒素分子在镇痛上的应用
本专利技术涉及一组具有高度亲和力、起效迅速、且蛋白质一级结构明确的眼镜蛇神经毒素分子和一种治疗疼痛的方法，该方法能用于治疗癌症引起的顽固性疼痛；同时也可用于治疗与神经性疾病、类风湿关节炎、病毒感染和其他相关病变引起的疼痛。该组眼镜蛇神经毒素分子在可接受的药物载体中用于注射、口服、舌下、鼻喷、直肠或透皮给药，属于生物制药领域。
技术介绍
早在20世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，我国自1952年起就开展对蛇毒的镇痛作用研究，开发了蛇毒粗毒制剂和蛇毒神经毒素制剂，用于临床治疗疼痛。眼镜蛇毒素就是其中一种，但眼镜蛇毒素种类繁多，已知成分有神经毒素、细胞毒素、心脏毒素、神经生长因子、溶血素(DLP)、CVA蛋白、膜活性多肽、眼镜蛇毒因子等及其他成分，如碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白水解酶等，其中眼镜蛇神经毒素是烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂，它与肌型和神经元型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)呈拮抗性和缓慢可逆性结合，此类眼镜蛇神经毒素因其能阻断烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的功能被称作为突触后神经毒素或α神经毒素。[1，2]烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)参与感觉、认知、疼痛和神经元的保护作用和神经体液传递，故烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)被阻断后认知、疼痛、神经元保护等作用就会受到不同程度的影响。眼镜蛇神经毒素从种类上讲有其多样性，虽然他们的空间结构相似，由3个相邻环(loop)组成独特结构，4个保守二硫键相互交联形成球型疏水核心，像3个伸出的“手指”，被称为三指蛋白，[3，4]但进一步细分的话，此类神经毒素又大致可分3种类型：即短链神经毒素(含60～62个氨基酸和4对二硫键)、长链神经毒素(含66～75个氨基酸和5对二硫键)和非传统三指神经毒素。[3]由此可见眼镜蛇神经毒素不是单一的一种毒素分子，每种短链，长链和非传统三指神经毒素中都包含着多种不一样的毒素分子，不同种类的毒素分子的氨基酸链的长短和氨基酸序列是不一样的，而且它们对烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的亲和力也是不一样的。目前市场上所有的神经毒素产品都是以提取物的形式出现，没有明确指出到底是哪一类神经毒素、或是哪一个毒素分子、或是它们的混合物。“科博肽“是根据Cobratide意为眼镜蛇的肽的英文发音翻译过来的，是一种从中华眼镜蛇(NajaNajaAtra)蛇毒中提取出的神经毒素的统称，它不是指专门的哪一个毒素分子，其质量控制标准只是要求神经毒素蛋白含量》80％，这种提取物被用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛等慢性疼痛的治疗。所以所有已上市的眼镜蛇神经毒素提取物无法明确告知究竟是哪一个毒素分子、或是那一类神经毒素、还是2种、甚至是2种以上的混合物。对于眼镜蛇毒素制剂，混合物会对临床安全性构成非常大的隐患，这是因为毒素混合物的协同作用是蛇毒中存在的一种重要现象，这可能是在进化过程中一种增强毒性的策略。各种蛇毒中不同类的毒素或同类毒素复合物之间存在协同作用，主要毒素如磷脂酶A2、三指毒素(神经毒素)在协同过程中发挥着重要作用。[5]一系列蛇种他们的毒素之间存在着协同作用。两种或两种以上的毒素成分直接或间接地相互作用，使毒性增强到超过其个体毒性总和的水平。从分子的角度来看，协同作用一般可能存在两种形式：(1)分子间协同作用，当两种或两种以上的毒素与一种或多种(相关)生物途径上的两种或两种以上的靶点相互作用时，引起协同增加的毒性。(2)超分子协同作用，当两种或两种以上毒素以协同方式与同一靶点相互作用或两种或两种以上毒素结合时创造一种毒性增加的复合物。[6]分子间协同作用的一个例子是来自于眼镜蛇科的α-神经毒素与其他毒素的结合，导致协同有效的毒性效应，导致受害者和猎物出现松弛性麻痹和呼吸衰竭。[6]在一项关于黑曼巴蛇(眼镜蛇)毒液如何导致高死亡率的研究中，科学家发现钾通道阻断活性只是其中之一，还有各种各样的途径，不同的毒素在不同器官水平诱导的综合毒性才是高死亡率的担忧。[7]Strydom和Botes的研究(1970年)表明，单独使用48小时后，从相关的东方绿曼巴(眼镜蛇)毒液中分离出的毒液组分没有杀伤力，而以类似剂量使用时，整个毒液在10分钟内就可以是致命的。[8]已知协同毒素可增强某些毒素的毒性，单独而言，这些蛋白质毒性较低，但当它们联合注射到小鼠体内时，会起到很强的毒性作用。这些毒素在氨基酸序列和半半胱氨酸数量上与神经毒素或细胞毒素相似，这种协同作用的毒素称为协同毒素。[9]根据公开发表的文献，已知的单个眼镜蛇神经毒素蛋白分子超过20个，在我国市场上销售的眼镜蛇神经毒素蛋白产品并没指明是哪一种类型的神经毒素蛋白或分子，唯一的质量控制方法是组分中神经毒蛋白的含量应在80％以上，缺乏确切的活性成分和残留杂质的信息可能会引起严重的安全性问题，因为混合物协同作用会导致致命毒副反应。“科博肽”的主要副作用是呼吸抑制和/或过敏，研究表明呼吸窘迫、[10]呼吸麻痹、[11]和呼吸衰竭[12]是毒蛇咬伤后的结果，同时也是混合毒素协同作用的结果。除毒素混合物的协同作用导致致命毒副作用外，眼镜蛇神经毒素提取物存在着镇痛起效慢、约2小时左右起效、临床疗效不稳定等现象，如下列报道：1.现有市售科博肽产品，存在原料批次间含量和纯度相对低、临床疗效不稳定、起效时间慢。陈汝筑，吴秀荣.眼镜蛇神经毒素的镇痛作用[J].中国药理学通报，1988，4(2)：113。[13]2.实验动物注射眼镜蛇神经毒素后2小时，大鼠痛阈显著上升，3小时后达到较佳效果，神经毒素镇痛作用起效慢，但维持时间长。陈燕，许云禄.舟山眼镜蛇神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究[J].海峡药学，2007，19(12)：27。[14]3.小鼠动物实验显示，给药后2小时起效，4小时作用达峰值。朱天新，袁彩君，任晚琼.眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究[J].华西药学杂志，2007，22(3)：247～249。[15]研究表明中枢神经系统(CNS)是眼镜蛇神经毒素镇痛的主要靶点部位，[16，17，18，]根据药代动力学研究，靶点的暴露和药物与靶点的结合被认为是药物成功的2个关键因素，药物与靶点结合的先决条件是靶点在超过药理学效应的浓度下暴露足够的时间。[19]对眼镜蛇神经毒素镇痛作用的研究表明，分子量大小从6.5KDa～15kDa的神经毒素蛋白分子可产生镇痛作用，[20，21]这些蛋白的SDS-PAGE分析如附图1所示。眼镜蛇神经毒素具有亲水性，其通过血脑屏障(BBB)的主要机制是被动转运。15kDa的毒素分子要比6.5kDa的分子需要更多的时间穿过血脑屏障，因为分子量的增加会减少血脑屏障的通透性。[22]神经毒素蛋白混合物达到药物靶点充分暴露浓度的总时间在很大程度上取决于混合物中高分子量和低分子量神经毒素蛋白的比例。此外，由于不同的神经毒素蛋白分子对烟碱乙酰胆碱受体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗病人或宿主疼痛的方法，通过使用该方法含有的治疗有效量的眼镜蛇毒素多肽的药物可接受载体的组合物来抑制或控制疼痛。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗病人或宿主疼痛的方法，通过使用该方法含有的治疗有效量的眼镜蛇毒素多肽的药物可接受载体的组合物来抑制或控制疼痛。


2.根据权利要求(1)以上所述眼镜蛇神经毒素多肽，其特征在于，它是具有A链眼镜蛇毒素，或A链眼镜蛇毒素B所示的氨基酸序列的眼镜蛇神经毒素多肽；或分别与A链眼镜蛇毒素，或A链眼镜蛇毒素B中的眼镜蛇神经毒素多肽具有70％或以上同源性的多肽，该多肽的功能与A链眼镜蛇毒素，或A链眼镜蛇毒素B所示的氨基酸序列的眼镜蛇神经毒素多肽功能相同或相似。


3.权利要求(1-2)以上所述眼镜蛇神经毒素多肽，其特征在于，它们可来自于从天然蛇毒中分离提取，或化学多肽合成，或是使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。


4.根据权利要求(1-3)以上所述重组生产的眼镜蛇神经毒素多肽，根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；可以是包含二硫键的，或可以是不包含二硫键的。本发明中所述的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。


5.权利要求(1-4)以上所述眼镜蛇神经毒素多肽，其特征还在于本发明中所述的多肽可包括上述各种眼镜蛇神经毒素多肽经过水解或酶解后的片段、用物理和化学方法处理后的衍生物和类似物，他们是基本保持着与上述眼镜蛇神经毒素多肽相同的生物学功能...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁展楷，祁·海亚特，
申请(专利权)人：祁展楷，
类型：发明
国别省市：上海;31