一种诱导低温弱光保存海带雄性种质发育的方法技术

本发明专利技术提供一种诱导低温弱光保存海带雄性种质发育的方法，即一种促进长期在低温弱光条件下保存海带雄性种质丝状体细胞快速发育成幼孢子体的方法。本发明专利技术的方法本发明专利技术是在丝状体片段阶段就提高到8000lx光照，针对不同发育时期，再逐渐降低到幼苗培育阶段的1000‑1500lx；刺激发育的温度为14℃；且在幼孢子体之前增加柠檬酸铁和维生素B12。本发明专利技术的方法可以有效的促进海带雄性种质的发育，再17‑20天即可使配子体细胞分裂产生幼孢子体；而且幼孢子体畸形率降低到40％‑60％。

A method of inducing male germplasm development of Laminaria japonica in low temperature and low light

【技术实现步骤摘要】
一种诱导低温弱光保存海带雄性种质发育的方法
本专利技术属于海藻发育诱导
，具体涉及一种诱导低温弱光保存海带雄性种质发育的方法。
技术介绍
海带是具异型世代交替的大型经济褐藻，自然生长的海带生活史包括短期的配子体和长期的孢子体阶段，成熟海带孢子体放散产生游孢子，游孢子附着后发育为雌、雄配子体，而配子体分别产生精卵，卵子受精形成合子，合子发育为幼孢子体。研究发现海带也存在雄性配子体细胞直接分裂发育成幼孢子体的情况，即无配生殖途径。我国的科研人员在1979年首次报道了海带的无配生殖途径，采集海带游孢子，经过3个多月发现部分雄配子的细胞膨大分裂成小孢子体。1997年发表的研究结果表明，经过2-3个月，采集的游孢子萌发成的雄配子体丝状体细胞经过2-3个月后能够发育成孢子体，而且正常状态的极少。无配生殖是单倍体发育成成体的一种，可用于单倍体育种。但目前已有的方法一般是在室内培育，如果培养时间过长，容易造成育种成本过高，且易被污染。尤其是在室内培育和自然生长条件差别较大，如果培育时间过长，一般藻体易生长不正常。
技术实现思路
本专利技术提供一种诱导低温弱光保存海带雄性种质发育的方法，即一种促进长期在低温弱光条件下保存的海带雄性种质丝状体细胞快速发育成幼孢子体的方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术所提供的促进海带雄性种质发育的方法，包括如下的步骤：1)将海带雄性种质丝状体放入到海水中12-36h，其中温度为4±1℃，每小时升高2℃，直至14±1℃；光照为1000lx，每小时升高1000lx，直至8000lx；2)将海带雄性种质丝状体进行粉碎，然后将粉碎的丝状体进行过滤获得8-16个细胞大小的丝状体片段；所述的粉碎，其实施例的一种具体记载是采用组织搅碎机粉碎，1500转/min，粉碎30s，所述的过滤，优选是使用单层500目筛绢过滤3-5次；3)将过滤获得丝状体片段进行培养，培养中的光源是荧光灯，光照强度8000±500lx，光照周期L﹕D＝12h﹕12h，培养温度为14±1℃；采用通气悬浮培养来获得膨大细胞；获得膨大细胞的培养液组成如下：4ppm的NO3-N、0.8ppm的PO4-P、1ppm的FeC6H5O7-Fe、：4ppm的GeO2、2μg/L的VB12；在培养期间，优选每三天更换1/5的培养液；4)诱导膨大细胞发育培养，培养中的光源是荧光灯，光照强度4000±200lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h，培养温度为14±1℃；通气悬浮培养获得幼孢子体；其中用于诱导膨大细胞发育培养的培养液组成为：4ppm的NO3-N、0.8ppm的PO4-P、1ppm的FeC6H5O7-Fe、4ppm的GeO2、VB12：2ug/L。每三天更换1/5的培养液。5)幼孢子体生长：将发育生成的幼孢子体进行培养，培养中光源是荧光灯，光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h，培养温度为10±1℃；每三天更换1/3的培养液。用于幼孢子体生长的培养液组成如下：8ppm的NO3-N、0.4ppm的PO4-P、4ppm的GeO2。本专利技术的方法可以有效的促进海带雄性种质的发育，再17-20天即可使配子体细胞分裂产生幼孢子体；而且幼孢子体畸形率降低到40％-50％。附图说明图1：将聚团的配子体克隆打碎后的片段图；图2：丝状体片段细胞膨大图；图3：膨大的细胞分裂产生幼孢子体图；图4：长大的幼孢子体图。具体实施方式相比较于已有的方法，本专利技术的方法具有如下三个不同点：一是大幅度提高光照强度，海带种质常规保存的光照是500-800lx，在肉眼可见幼孢子体之前的光照是低于2500lx。而本专利技术是在丝状体片段阶段就提高到8000lx光照，针对不同发育时期，再逐渐降低到幼苗培育阶段的1000-1500lx；二是提高刺激发育的温度，一般海带幼苗发育生长温度是8-12℃，而本专利技术在实验室内不断摸索，发现14℃左右时刺激效果较好；三是改良培养液成分，在幼孢子体之前增加柠檬酸铁和维生素B12，并且研究了最佳浓度组合，从而是培养液更适合于低温弱光条件下海带雄性种质发育。以下对本专利技术技术方案的具体实施方式详细描述，但本专利技术并不限于以下描述内容：实施例11)准备无配发育种质材料从种质库中选择色泽深褐，无杂藻污染的“东方2号”海带雄性种质丝状体，倒出一部分种质用于诱导材料；用于诱导种质的放在500ml无菌海水中。2)诱导前处理将用于诱导的种质在诱导前24h置于诱导培养箱中，培养温度为14±1℃，光源为荧光灯管，光照为1000lx，每小时升高1000lx，直至8000lx。3)诱导细胞膨大处理将种质用组织搅碎机粉碎，一般是1500转/min，粉碎30s，重复2次，然后用单层500目筛绢过滤3次，至8-15个细胞的细胞段。将打碎的细胞段放在培养箱中培养，培养条件是：光源是荧光灯，光照强度8000±300lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h。培养温度为14±1℃。每三天更换1/5的培养液。通气悬浮培养7天。培养液组成为：NO3-N：4ppm，PO4-P：0.8ppm，FeC6H5O7-Fe：1ppm，GeO2：ppm，VB12：2ug/L。经过14天，显微观察细胞共98个，有15个细胞明显膨大，比例约为15％。经过16天，观察细胞共101个，有76个细胞明显膨大，比例约为75％。统计方法：随机统计10个丝状体片段，其中膨大率＝膨大细胞数/配子体细胞数。随后调整为诱导发育阶段。4)诱导膨大细胞发育：膨大细胞发育的培养条件如下：光源是荧光灯，光照强度4000±200lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h。培养温度为14±1℃。每三天更换1/5的培养液。培养液组成为：NO3-N：4ppm，PO4-P：0.8ppm，GeO2：4ppm，VB12：2ug/L。诱导发育3天后，显微观察68个细胞，发现有24个雄性种质片段膨大细胞分裂，比例为35％。再经过5天，显微观察66个细胞，发现有37个雄性种质片段膨大细胞分裂，比例为56％。5)幼孢子体生长：将发育生成的幼孢子体放在培养箱中培养，培养条件是：光源是荧光灯，光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h。培养温度为10±1℃。每三天更换1/3的培养液。微流水培养。培养液组成为：NO3-N：8ppm，PO4-P：0.4ppm，GeO2：4ppm。待幼孢子体肉眼可见时，显微观察发现，48％的幼孢子体的形状符合正常海带幼苗特征，细胞分布均匀，单细胞形状正常，但是幼苗较细长。统计方法：随机观察3个视野，每个视野观察20个幼孢子体。畸形率(％)＝(畸形幼孢子体/60)100％培养20天后，待幼孢子产生较多的时候运本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进海带雄性种质发育的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：/n1)将海带雄性种质丝状体放入到海水中12-36h，其中温度为4±1℃，每小时升高2℃，直至14±1℃；光照为1000lx，每小时升高1000lx，直至8000lx；/n2)将海带雄性种质丝状体进行粉碎，然后将粉碎的丝状体进行过滤获得8-16个细胞大小的丝状体片段；/n3)将过滤获得丝状体片段进行培养，培养中的光源是荧光灯，光照强度8000±500lx，光照周期L﹕D＝12h﹕12h，培养温度为14±1℃；采用通气悬浮培养来获得膨大细胞；/n4)诱导膨大细胞发育培养，培养中的光源是荧光灯，光照强度4000±200lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h，培养温度为14±1℃；通气悬浮培养获得幼孢子体；/n5)幼孢子体生长：/n将发育生成的幼孢子体进行培养，培养中光源是荧光灯，光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h，培养温度为10±1℃；每三天更换1/3的培养液。/n

【技术特征摘要】
1.一种促进海带雄性种质发育的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)将海带雄性种质丝状体放入到海水中12-36h，其中温度为4±1℃，每小时升高2℃，直至14±1℃；光照为1000lx，每小时升高1000lx，直至8000lx；
2)将海带雄性种质丝状体进行粉碎，然后将粉碎的丝状体进行过滤获得8-16个细胞大小的丝状体片段；
3)将过滤获得丝状体片段进行培养，培养中的光源是荧光灯，光照强度8000±500lx，光照周期L﹕D＝12h﹕12h，培养温度为14±1℃；采用通气悬浮培养来获得膨大细胞；
4)诱导膨大细胞发育培养，培养中的光源是荧光灯，光照强度4000±200lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h，培养温度为14±1℃；通气悬浮培养获得幼孢子体；
5)幼孢子体生长：
将发育生成的幼孢子体进行培养，培养中光源是荧光灯，光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h，培养温度为10±1℃；每三天更换1/3的培养液。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王翔宇，丁刚，刘玮，吴海一，李大鹏，
申请(专利权)人：山东省海洋生物研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37