细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒。所述方法包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。该方法可以显著缩短检测时间，最快约10分钟左右即可完成检测，且检测准确度好，效率高。

Cell cycle detection method and its reagents and kits

【技术实现步骤摘要】
细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒。
技术介绍
真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续阶段的细胞周期来进行。细胞周期进展是通过许多细胞周期调节相关的信号通路(特别是周期蛋白相关通路)在规定时间和空间激活或关闭来严格控制的，它们在细胞周期期间呈现高度的动态性。例如，在特定的细胞周期阶段，一些蛋白质从细胞核转移到细胞质，或者相反，以及一些蛋白质被迅速降解等。细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至关重要的。目前细胞周期检测方法通常有以下几种：1.同位素标记法测定细胞周期标记有丝分裂百分率法(percentagelabeledmitoses，PLM)是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。2.基于成像的荧光检测法FUCCI(fluorescentubiquitination-basedcell-cycleindicator,FUCCI)小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期，因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中geminin融合的是绿色荧光基团AmCyan，而Cdt1融合的是红色荧光基团mCherry。Cdt1和geminin的水平随着细胞周期的变化而不断波动：Cdt1蛋白水平在G1阶段达到峰值，而geminin蛋白水平在S、G2和M期不断升高。这一结果体现为表达FUCCI细胞核在G1期为红色而在S、G2和M期则呈现绿色。3.流式细胞术PI(PropidiumIodide，碘化丙啶)染色法由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期、S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。主要方法简述如下：收集细胞；加入75％乙醇；放置过夜(大于24小时)；洗涤后RNaseI(RNA酶I，10mg/ml，无DNA酶活性)消化并PI(1mg/ml)染色；上机检测。然而方法1放射性污染严重，设备要求极高。方法2操做复杂且设备要求高，单次实验成本高。方法3流式细胞术PI染色法是主流检测方法。然而整个检测从细胞准备好后，加入75％乙醇作用，细胞固定同时被打孔，至少需要花费24小时才能上机检测，对于药企研发和科研研究来说造成了很大的时间损耗。且方法3中，乙醇固定、PI染色与RNA消化是分三步进行的，耗时耗力。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种细胞周期检测方法，包括：使用0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。该方法可以显著缩短检测时间，最快约10分钟左右即可完成检测，且检测准确度好，效率高。本专利技术的第二目的在于提供一种用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：种类和使用量为如上所定义的皂素、DNA结合染料与核糖核酸酶。本专利技术的第三目的在于提供一种试剂盒，其包含如上所述的试剂，或用于配置所述试剂的各组分。所述试剂和试剂盒用于执行上述方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：本专利技术一个实施例中75％乙醇处理(阳性对照)的实验结果；图2：本专利技术一个实施例中1％saponin+1％多聚甲醛的实验结果；图3：本专利技术一个实施例中0.5％saponin+1％多聚甲醛的实验结果；图4：本专利技术一个实施例中0.1％saponin+1％多聚甲醛的实验结果；图5：本专利技术一个实施例中0.1-0.25％saponin+0.1％Tween20的实验结果；图6：本专利技术一个实施例中0.1-0.25％saponin+0.1％TritonX-100的实验结果；图7：本专利技术一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS0分钟的实验结果；图8：本专利技术一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS5分钟的实验结果；图9：本专利技术一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS10分钟的实验结果；图10：本专利技术一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS15分钟的实验结果；图11：本专利技术一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS+100ug/mlPI+1mg/mlRNaseI10分钟的实验结果。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本专利技术更广阔的方面。本专利技术涉及一种细胞周期检测方法，包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。通过对所述DNA结合染料进行检测可以确定细胞所在周期，这对本领域技术人员是容易的。0.06％～0.3％(g/ml)的皂素浓度是以分析纯级别皂素计。其浓度还可以选择(g/ml)0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.20％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％和0.29％；优选0.08％～0.12％(g/ml)或0.23％～0.27％(g/ml)；更优选0.09％～0.11％(g/ml)或0.24％～0.26％(g/ml)；最优选0.10％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞周期检测方法，包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。/n

【技术特征摘要】
1.细胞周期检测方法，包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。


2.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，所述皂素的浓度为0.08％～0.12％(g/ml)或0.23％～0.27％(g/ml)。


3.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，将所述皂素、所述DNA结合染料和所述核糖核酸酶与所述细胞共孵育。


4.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，所述DNA结合染料选自碘化丙啶、7-氨基放线菌素D、Hoechst33342、Hoechst33258、HoechstS769121、TO-PRO-3、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、DRAQ5TM和DRAQ7TM中的一种或多种；
优选的，所述DNA结合染料为70μg/ml～130μg/ml的碘化丙啶。


5.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，所述核糖核酸酶选自RNaseI、RNaseIII、RNaseB、RNaseD、RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佐青，刘津，陈大为，王胜旺，邓少华，康恺，
申请(专利权)人：菲诺克生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31