用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用技术

本发明专利技术涉及用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术采用信息分析技术，对29种在CHO细胞中常用的高分泌表达信号肽和外源蛋白串联序列进行分析，最终选择分析结果合适的10种信号肽，通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5’端相连，分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western blot检测CHO培养基中重组表位蛋白的累积差异,结果证明蛋白累计差异与本方法选择结果相符合，从而证明了所述方法的可行性。

Selection and application of signal peptide in expression of foreign protein by Chinese hamster ovary cells

【技术实现步骤摘要】
用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用
本专利技术属于生物
，进一步，涉及信号肽，具体地，涉及一种用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用。
技术介绍
中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycell,CHO)是表达药用生物活性大分子的首选，CHO很少分泌自身的内源蛋白，有利于蛋白的纯化。分泌表达是CHO的主要表达途径，但许多蛋白质(细胞因子等)的表达相对较低，增加细胞分泌的能力能显著促进重组蛋白的表达。在CHO细胞表达分泌性蛋白质过程中，起初会合成由15-30个疏水性氨基酸组成的信号肽，信号肽随后被细胞质中的信号识别颗粒(Signal-RecognitionParticle,SRP)所识别，识别后导致蛋白质合成暂停，随后核糖体与内质网膜结合，信号肽依靠其疏水性插入内质网膜腔内,在核糖体结合内质网膜后SRP将会离开，处于暂停状态的蛋白质合成重新开始。而后信号肽酶对信号肽进行切割。一个合适的信号肽有助于提高重组蛋白的表达水平。但是，信号肽和外源蛋白N端相连会发生切割位点的偏移，发生切割目的蛋白氨基酸的可能。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，通过该方法可以选择适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。本专利技术的目的之二在于提供所信号肽的选择方法在表达O型口蹄疫病毒重组表位蛋白过程中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：首先选取能在中国仓鼠卵巢细胞中高分泌表达蛋白的信号肽作为待选择信号肽；将待选择信号肽分别与外源目的蛋白进行串联，获得重组蛋白；通过信号肽分析工具分析重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确的重组蛋白序列上的信号肽，即为适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。作为对上述方案的进一步优化，在所述待选择信号肽与外源目的蛋白进行串联时，在待选择信号肽与外源目的基因之间引入GGSSGG间隔子；通过信号肽分析工具分析后选择切割位点分析准确且落在间隔子上的重组蛋白。作为对上述方案的更进一步优化，在所述外源目的蛋白含有多个表位时，在每两个相邻的表位之间引入GGSSGG间隔子。本专利技术还请求保护所述信号肽的选择方法在中国仓鼠卵巢细胞分泌表达外源目的蛋白中的应用。进一步地，所述应用是利用所述信号肽选择方法选择适合O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达的信号肽，包括以下步骤：步骤一、选择O型口蹄疫病毒VP1蛋白的21～60AA、141～160AA和200～213AA作为优势表位；连接三个所述优势表位构建多表位基因表达盒；其中，在连接三个所述优势表位时在每两个相邻的优势表位之间引入GGSSGG间隔子；步骤二、从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源目的基因的信号肽作为待选择信号肽，将待选择信号肽分别与步骤一所得多表位基因表达盒连接，连接时在待选择信号肽和多表位基因表达盒之间分别选用引入GGSSGG间隔子和不引入GGSSGG间隔子两种连接方式，获取重组蛋白；步骤三、使用信号肽分析工具分析步骤二所得重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在间隔子上的信号肽，即为适合O型口蹄疫病毒蛋白表达的信号肽。有益效果：本专利技术所述信号肽的选择方法，改变了现有技术中在未知信号肽是否适合的前提下从已有报道中将信号肽直接拿来使用从而导致重组蛋白表达水平低的弊端，首次提出一种信号肽的选择方法，所述方法首先是在现有技术中选择出能在CHO细胞中高分泌表达蛋白的信号肽，将其与外源目的蛋白的表位基因串联后进行分析，通过分析选择出适合外源目的蛋白表达的信号肽，再对其进一步运用，大大提高了工作效率，同时节约成本。附图说明图1是信号肽切割位点的信息学分析；其中，2O-1：Erythropoietin信号肽引入间隔子；2O-2：Humantrypsinogen-2信号肽引入间隔子；2O-3：Oikosin1mutant信号肽引入间隔子；2O-4：Azurocidinpreproprotein信号肽引入间隔子；2O-5：IgkappachainV-IIIregion信号肽引入间隔子；2O-6：ApolipoproteinB-100precursor信号肽引入间隔子；2O-7：Serumalbuminpreproprotein信号肽引入间隔子；2O-8：UL16-bindingprotein2preproprotein信号肽引入间隔子；2O-9：scrapie-responsiveprotein1precursor信号肽引入间隔子；2O-10：SCGB1D1isoform1信号肽引入间隔子；2O:Serumalbuminpreproprotein信号肽未引入间隔子；图2是重组质粒pCI-neo-O的酶切鉴定；其中，M1：DNA标尺(DL10000)；1：2O-1未经酶切；2：2O-1经XhoI及NotI酶切；3：2O-2未经酶切；4：2O-2经XhoI及NotI酶切；5：2O-3未经酶切；6：2O-3经XhoI及NotI酶切；7：2O-4未经酶切；8：2O-4经XhoI及NotI酶切；9：2O-5未经酶切；10：2O-5经XhoI及NotI酶切；11：2O-6未经酶切；12：2O-1经XhoI及NotI酶切；M2：DNA标尺(DL10000)；13：2O-7未经酶切；14：2O-7经XhoI及NotI酶切；15：2O-8未经酶切；16：2O-8经XhoI及NotI酶切；17：2O-9未经酶切；18：2O-9经XhoI及NotI酶切；19：2O-10未经酶切；20：2O-10经XhoI及NotI酶切；21：2O未经酶切；22：2O经XhoI及NotI酶切；23：pCI-neo未经酶切；24：pCI-neo经XhoI及NotI酶切；图3是pCI-neo-O真核表达载体图谱；其中，KOZAK:KOZAK序列；SignalPeptide：信号肽序列；RE：多表位基因序列；图4是Westernblot检测不同信号肽介导O型口蹄疫病毒重组表位蛋白质水平差异；其中，1：2O-1；2：2O-2；3：2O-3；4：2O-4；5：2O-5；6：2O-6；7：2O-7；8：2O-8；9：pCI-neo；10：2O-9；11：2O-10；12：2O；13：转染空质粒pCI-neo培养基上清。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1信号肽切割位点的信息学分析选择O型口蹄疫(GenBank:QDJ95689.1)VP1蛋白的21～60AA、141～160AA和200～213AA作为优势表位，合理地连接它们以构建多表位基因表达盒。为了在两个相邻表位连接后防止新表位的形成，在表位之间引入GGSSGG间隔子序列以确保靶标抗原位的正确性。从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源蛋白的信号肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：首先选取能在中国仓鼠卵巢细胞中高分泌表达蛋白的信号肽作为待选择信号肽；将待选择信号肽分别与外源目的蛋白进行串联，获得重组蛋白；通过信号肽分析工具分析重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确的重组蛋白序列上的信号肽，即为适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。/n

【技术特征摘要】
1.用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：首先选取能在中国仓鼠卵巢细胞中高分泌表达蛋白的信号肽作为待选择信号肽；将待选择信号肽分别与外源目的蛋白进行串联，获得重组蛋白；通过信号肽分析工具分析重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确的重组蛋白序列上的信号肽，即为适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。


2.根据权利要求1所述的用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：在所述待选择信号肽与外源目的蛋白进行串联时，在待选择信号肽与外源目的基因之间引入GGSSGG间隔子；通过信号肽分析工具分析后选择切割位点分析准确且落在间隔子上的重组蛋白。


3.根据权利要求2所述的用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：在所述外源目的蛋白含有多个表位时，在每两个相邻的表位之间引入GGSSGG间隔子。


4.权利要求1-3任意一种所述的信号肽的选择方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，孙振文，邵军军，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62