一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种川芎咖啡酸‑O‑甲基转移酶突变体及其用途，属于生物工程技术领域。突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；突变体的获得是基于发现318位氨基酸是影响活性的一个关键位点并用定点突变将其318位的异亮氨酸残基(I)突变成苏氨酸残基(T)；利用生物工程技术将突变体重组蛋白表达纯化分离出来。转移酶突变体的应用会明显提高作为催化剂时的咖啡酸甲酯转化效率，在酶法合成阿魏酸甲酯的方法中具有较好的应用前景。

A mutant of caffeic acid-o-methyltransferase from Ligusticum chuanxiong and its application

【技术实现步骤摘要】
一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体及其用途
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体及其用途。
技术介绍
阿魏酸甲酯是一种紫外吸收剂，其对280nm～360nm波长的紫外线有良好的吸收能力且吸收率高，具有抗氧化、美白与消炎等功效。比如，在化妆品加入阿魏酸甲酯，不仅能够起到美白作用，长期使用还能够使皮肤具有绢质感。并且，阿魏酸甲酯还可作为强效美白剂阿魏酸异辛酯的合成中间体。最后，阿魏酸甲酯也是一个重要的医药中间体。本课题组在前1个申请专利即“一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法(申请号201910261291.2)”中，首次提出以川芎咖啡酸-O-甲基转移酶(LigusticumchuanxiongcaffeicacidO-methyltransferase，以下均简写为LcCOMT)为催化剂，以咖啡酸甲酯和S-腺苷甲硫氨酸为底物，采用体外酶促反应合成阿魏酸甲酯，从而为阿魏酸甲酯的制备提供了一种新的方法。本专利技术精准分析LcCOMT的三维结构，预测318位的异亮氨酸残基改变后可能对酶活性产生影响。因此，课题组将318位的异亮氨酸突变为苏氨酸残基，获得LcCOMT-I318T突变体。相比于野生型LCCOMT，LcCOMT-I318T突变体的转化效率明显提高，具有更低的Km值，更高的Vmax及Kcat值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体(以下均简称为LcCOMT-I318T突变体)。与野生型LcCOMT比较，LcCOMT-I318T突变体的酶促活性更高，对咖啡酸甲酯具有更低的Km值、更高的Vmax值及Kcat值。该突变体的主要用途，能够为酶促反应合成阿魏酸甲酯提供活性更高的优质酶源，从而降低使用成本。实现上述目的的技术措施是：本专利技术提供了一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶LcCOMT-I318T突变体，所述突变体命名为LcCOMT-I318T，其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。还提供了所述川芎咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。所述的咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的氨基酸序列，利用定点突变将LcCOMT中第318位的异亮氨酸残基(I)突变成苏氨酸残基(T)。本专利技术将上述突变体的核苷酸编码序列构建成重组载体，并在大肠杆菌BL2高效表达，获得重组菌株，通过发酵、提取等技术获得重组蛋白。所述表达载体为LcCOMT-I318T-pET28a质粒，宿主细胞为大肠杆菌BL21。本专利技术还提供了在一种快速生物合成阿魏酸甲酯工艺领域中的用途。本专利技术所涉及的技术措施还包括LcCOMT-I318T突变体重组载体的构建；LcCOMT-I318T突变体重组菌株的获得；LcCOMT-I318T突变体的表达纯化；LcCOMT-I318T突变体的酶活检测等部分。(1)LcCOMT-I318T突变体重组载体的构建1.1从大肠杆菌DH5α中提取LcCOMT-pET28a质粒，该质粒构建方法请见本课题组先前申请的专利(一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法，申请号201910261291.2)。1.2设计突变引物，以LcCOMT-pET28a质粒为模板，利用购于诺唯赞的MutExpressIIFastMutagenesisKitV2试剂盒构建LcCOMT-I318T-pET28a突变体质粒。(2)LcCOMT-I318T突变体重组菌株的获得2.1突变质粒LcCOMT-I318T-pET28a转入感受态大肠杆菌BL21，50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板抗性筛选及测序确认开放阅读框无误，获得含有LcCOMT-I318T-pET28a的基因工程菌；(3)LcCOMT-I318T突变体表达表达条件：37℃，200rpm将重组菌株培养至OD600＝0.6～0.8；加入IPTG，使其终浓度为0.3mM/L，23-25℃培养8～10h；培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；蒸馏水溶解后，高温高压灭菌。(4)LcCOMT-I318T突变体纯化4.1将步骤3中得到的菌液于4℃，5000g，离心10min离心收集菌体；4.2用10mLTris-HCl，pH7.9的缓冲液(20mM咪唑、10mMTris-HCl，pH7.9，500mMNaCl)重悬菌体，超声裂解菌体(超声程序为60W，工作3s、暂停3s，冰浴条件下超声30min。超声完成后，离心(4℃，13000g，10min)去除细胞碎片，收集上清液；4.3将上清液加入镍离子亲和层析柱，4℃结合2h后，流出穿透液；4.4用20mL的结合液洗脱非特异结合的杂蛋白，结合液配方为60mM咪唑，10mMTris-HCl，pH7.9，500mMNaCl，然后用5mL的洗脱液洗脱LcCOMT-I318T突变体，洗脱液配方为200mM咪唑，10mMTris-HCl，pH7.9，500mMNaCl，得到LcCOMT-I318T突变体溶液；4.5将LcCOMT-I318T突变体溶液在透析液中进行第1次透析，透析液配方为2mMTris-HCl，pH7.4，10％甘油，β-巯基乙醇0.5mM，250mMNaCl，透析袋截留分子量为8000-14000；4-5h后更换透析液，进行第二次透析，第2次透析液成分：2mMTris-HCl，pH7.4，10％甘油，β-巯基乙醇0.5mM，150mMNaCl；4-5h后，更换透析液，进行第2次透析，第3次透析液成分与第2次透析液成分相同，透析12-16h，收集透析袋中的蛋白液，获得LcCOMT-I318T突变体。(5)LcCOMT-I318T突变体的酶活检测5.1酶活反应体系包括突变体，S-腺苷甲硫氨酸，咖啡酸甲酯，二硫苏糖醇，200mMTris-HCl，pH7.0，总体积为10mL，反应温度为37℃，反应结束后，加如1mL浓盐酸终止反应；5.2向反应液中加5mL乙酸乙酯萃取，收集萃取液；再重复萃取两次，合并萃取液，将萃取液转移到圆底烧瓶，通过旋蒸使其完全蒸发，溶质析出附着于圆底烧瓶内；5.3向烧瓶内加入溶液(甲醇：甲酸＝95:5)洗涤烧瓶，使溶质溶解，收集洗涤液。再用溶液(甲醇：甲酸＝95:5)洗涤烧瓶数次，收集合并所有洗涤液，定容至5mL，作为样品待检测；5.4HPLC检测，将上步待测样品过0.45μm滤头后，作为HPLC样品，流动相为甲醇：0.1％磷酸＝45:55，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长330nm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供了一种新的突变体。2、该突变体具有更高的转化效率，对咖啡酸甲酯具有更低的Km值、更高的Vmax及Kcat值，能够提高阿魏酸甲酯的合成效率，降低成本。附图说明图1获得LcCOMT-I318T突变体的方法流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体命名为LcCOMT-I318T，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体命名为LcCOMT-I318T，其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。


2.根据权利要求1所述川芎咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。


3.根据权利要求1所述的咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的氨基酸序列，利用定点突变将LcC...

【专利技术属性】
技术研发人员：周嘉裕，廖海，严子成，廖东颖，陈安琪，李秋娥，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川;51