一种H13N8重组流感病毒及应用制造技术

本公开属于流感疫苗技术领域，具体涉及一种H13N8重组流感病毒及应用。本公开构建了一种H13N8重组流感病毒，通过基因合成获得PR8病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因，并将合成的基因通过同源重组的方式插入pFluDD双向表达载体中。将6个PR8病毒内部基因感染性克隆质粒与2个H13N8亚型流感病毒抗原基因感染性克隆按比例共转染293T细胞，将转染后的细胞悬液接种SPF鸡胚，收获血凝阳性的鸡胚尿囊液，获得H13N8重组流感病毒。将H13N8重组流感病毒灭活疫苗颈部皮下注射免疫3周龄SPF鸡，免疫后第4周，免疫组鸡血清中抗H13N8亚型流感病毒的血凝抑制效价达到160‑640。

A h13n8 recombinant influenza virus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种H13N8重组流感病毒及应用
本公开属于流感疫苗
，具体涉及一种H13N8重组流感病毒以及该重组流感病毒作为灭活疫苗的应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。流感是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。流感病毒即可以感染人类也可以感染多种动物，包括陆禽、水禽和野鸟等，对养殖业和公共卫生安全均构成严重威胁。流感病毒根据病毒基因组成和序列同源性等可分为A型、B型、C型和D型流感病毒，其中以A型流感病毒危害最大。近一百年来，人类一共发生过四次流感大流行，包括1918年西班牙流感、1957年亚洲流感、1968年香港流感和2009年甲型H1N1流感，四次流感大流行给人类社会造成重大伤害，研究表明四次流感大流行的病原均为A型流感病毒。A型流感病毒是RNA病毒，由于病毒RNA聚合酶的错配率较高，因此病毒基因基因尤其是病毒主要抗原基因血凝素(Hemagglutinin,HA)基因和NA(Neuraminidase,NA)基因极易发生变异。截止目前为止，A型流感病毒一共有16种HA亚型和9种NA亚型。H13亚型流感病毒以往只在野鸟和水禽中被发现，不感染陆禽。专利技术人所在研究团队从2016年至今通过血清学调查在蛋鸡中发现H13亚型流感病毒存在的血清学证据，并在样品中检测到H13亚型流感病毒核酸的存在。以上研究结果表明H13亚型流感病毒对蛋鸡构成潜在威胁，由此有必要开展H13亚型流感病毒疫苗的研制，以应对将来出现的疫情威胁。
技术实现思路
基于上述研究背景，本公开构建了一种H13N8重组流感病毒，以流感病毒鸡胚适应株A/PuertoRico/8/34/MountSinai(H1N1)(简称PR8病毒)作为骨架，包含H13N8亚型流感病毒抗原，其灭活后的产品用于蛋鸡免疫具有良好的血凝抑制效价。基于上述研究结果，本公开提供以下技术方案：本公开第一方面，提供一种H13N8重组流感病毒，所述重组流感病毒以鸡胚适应株PR8病毒内部基因为骨架，以H13N8亚型流感病毒的HA和NA基因为抗原；所述PR8病毒内部基因为PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因。优选的，所述PB2基因序列如SEQIDNO:1所示；优选的，所述PB1基因序列如SEQIDNO:2所示；优选的，所述PA基因序列如SEQIDNO:3所示；优选的，所述NP基因序列如SEQIDNO:4所示；优选的，所述M基因序列如SEQIDNO:5所示；优选的，所述NS基因序列如SEQIDNO:6所示；优选的，所述HA基因序列如SEQIDNO:7所示；优选的，所述NA基因序列如SEQIDNO:8所示。本公开第二方面，提供一种H13N8重组流感病毒的制备方法，将PR8病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因与H13N8的HA和NA基因共同导入宿主细胞中培养获得所述H13N8重组流感病毒。优选的，所述PR8病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因与H13N8的HA和NA基因是通过含有PB2基因的重组载体、含有PB1基因的重组载体、含有PA基因的重组载体、含有NP基因的重组载体、含有M基因的重组载体、含有NS基因的重组载体、含有HA基因的重组载体、含有NA基因的重组载体共同导入宿主细胞中。进一步优选的，所述重组载体的表达载体为pFluDD，所述载体由pUC18载体(ThermoFisherScientific公司)改造而成，具体是将CMV启动子、鼠RNA聚合酶I终止子、人RNA聚合酶I启动子和SV40多聚腺苷酸化信号依次插入到pUC18载体上构建获得。优选的，所述宿主细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、HL-8细胞中的一种或多种，优选为293T细胞。本公开第三方面，提供第一方面所述H13N8重组流感病毒在制备临床检查和/或评估流感疫苗产品中的应用。优选的，所述流感疫苗为H13N8病毒疫苗。本公开第四方面，提供一种疫苗，所述疫苗为第一方面所述H13N8重组流感病毒的灭活制剂。优选的，所述疫苗中还包括冻干保护剂及稳定剂等佐剂。与现有技术相比，本公开的有益效果是：本公开通过反向遗传技术获得了一种重组病毒，能够在鸡胚第一代就获得重组病毒，病毒滴度高，灭活后的制剂具有良好的免疫原性，并且生产较为方便。本公开提供的构建方法简单，且生产成本低，该疫苗应用于开发防治家禽流感病毒的制剂具有良好的经济意义。附图说明构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。图1为实施例1中H13N8/PR8重组流感病毒拯救路线图；图2为实施例3中H13N8/PR8A免疫3周龄SPF鸡1周、2周、3周和4周的血凝抑制抗体水平示意图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本公开提供了一种H13N8重组流感病毒及应用。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。实施例1H13N8/PR8重组流感病毒的转染拯救(1)根据NCBIGenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)提供的鸡胚适应株A/PuertoRico/8/34/MountSinai(H1N1)(简称PR8)的基因组序列，送青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成PR8病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因，并将合成的基因通过同源重组的方式分别插入到本实验室构建的pFluDD双向表达载体中，构建6个插入PR8病毒相应基因片段的感染性克隆分别命名为pFluDD-PR8-PB2、pFluDD-PR8-PB1、pFluDD-PR8-PA、pFluDD-PR8-NP、pFluDD-PR8-M和pFluDD-PR8-NS；所述pFluDD双向表达载体由pUC18载体(ThermoFisherScientific公司)改造而成，具体是将CMV启动子、鼠RNA聚合酶I终止子、人RNA聚合酶I启动子和SV40多聚腺苷酸化信号依次插入到pUC18载体上构建获得。(2)6孔细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种H13N8重组流感病毒，其特征在于，所述重组流感病毒以鸡胚适应株PR8病毒内部基因为骨架，以H13N8亚型流感病毒的HA和NA基因为抗原；所述PR8病毒内部基因为PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种H13N8重组流感病毒，其特征在于，所述重组流感病毒以鸡胚适应株PR8病毒内部基因为骨架，以H13N8亚型流感病毒的HA和NA基因为抗原；所述PR8病毒内部基因为PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因。


2.如权利要求1所述H13N8重组流感病毒，其特征在于，所述PB2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；
或所述PB1基因序列如SEQIDNO:2所示；
或所述PA基因序列如SEQIDNO:3所示；
或所述NP基因序列如SEQIDNO:4所示；
或所述M基因序列如SEQIDNO:5所示；
或所述NS基因序列如SEQIDNO:6所示；
或所述HA基因序列如SEQIDNO:7所示；
或所述NA基因序列如SEQIDNO8所示。


3.一种H13N8重组流感病毒的制备方法，其特征在于，将PR8病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因与H13N8的HA和NA基因共同导入宿主细胞中培养获得所述H13N8重组流感病毒。


4.如权利要求3所述H13N8重组流感病毒的制备方法，其特征在于，所述PR8病毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因与H13N8的HA和NA基因是通过含有PB2基因的重组载体、含有PB1基因的重组载体、含有PA基因的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志君，朱彤，吴家强，陈为京，高月花，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37