一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一株可整合且高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用。该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌ZD‑708(ΔGAΔEGL)，是在一株可高效产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌LKT‑10261的基础上，经过ARTP诱变后获得ZD‑708菌株，在ZD‑708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得，并且其限制修饰系统对pKS1质粒的剪切修饰已失效。该菌株发酵培养获得的中性蛋白酶酶活为20200‑21930U/ml，上清中的蛋白含量为95‑100mg/mL，所表达的蛋白酶活水平高，大大降低了生产成本，拓宽了酶的应用领域。

A Bacillus amylolyticus strain secreting and expressing foreign protein efficiently and its application

【技术实现步骤摘要】
一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用
：本专利技术属于生物
，具体涉及一株可整合且高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
：随着生物技术的发展，为了降低生产成本、拓展作用条件及范围，满足市场多样化产品的需求，需要开发或者优化出多株针对不同产品的，产酶活力高、生产稳定性好、适应强的生产菌株。由于多个新菌株的开发耗时较长，且往往是多个品种的酶产品由同一类的菌株来生产，因此，利用同一类表达系统的菌株，生产多个不同的酶产品，会使生产研发的速度加快，紧跟市场瞬息万变的行业动态，最大限度度的满足市场的各种需求。例如毕赤酵母的表达系统，枯草芽孢杆菌的表达系统，地衣芽孢杆菌的表达系统等等。解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属，是美国食品和药品管理局公认的安全微生物。从上世纪60年代开始就有报道，2007年公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组序列，使人们更深入的认识了解解淀粉芽孢杆菌。该菌不污染环境，在自然界分布广泛，易分离培养，且生长快，稳定性好，目前已广泛用于酶制剂生产。DNA同源重组的方法敲除目的基因，即设计目的基因两边相邻的基因片段并连接在一起，通过转化宿主细胞，在宿主内通过此相邻片段与目的基因两边相同片段的交换重组，完成对目的基因的敲除。在此敲除过程中，载体、转化方法和筛选标记的选择对建立一个高效稳定的操作体系产生重要影响。温敏型质粒是一类可以在特定温度下可以自主复制，而高于特定温度时无法自主复制的质粒。同时温敏型质粒将质粒转化入宿主细胞和在宿主细胞中发生同源重组的两个过程分开进行，极大的提高了敲除的成功率，特别是对于解淀粉芽孢杆菌这种难转化的细菌类型。温敏型质粒例如pE194和pKS1等，其中pE194使用的时间最早，最广泛，但质粒本身较大，转化难度相对较大，且在使用过程中，在一些菌株中会出现对温度不敏感的情况，当温度升高至40度时，仍有部分细胞中的质粒会保持游离状态。pKS1在30度时自主复制，37度时停止复制，对温度的变化更为敏感。2010年Zakataeva等首次将pKS1质粒运用到解淀粉芽孢杆菌中，同时建立了解淀粉芽孢杆菌的敲除方法。野生型解淀粉芽孢杆菌的转化率较低，且由于菌体内修饰系统的限制，目前，针对解淀粉芽孢杆菌的筛选及针对其表达系统改造的专利，未见报道。
技术实现思路
：本专利技术首先提供一株可高效分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacilluseamyloliquefaciens)ZD-708(ΔGAΔEGL)，是在一株可高效产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌LKT-10261的基础上，经过ARTP诱变后获得ZD-708菌株，在ZD-708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得，并且其限制修饰系统对pKS1质粒的剪切修饰已失效；所述糖化酶基因GA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；所述纤维素酶基因EGL的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示；解淀粉芽孢杆菌(Bacilluseamyloliquefaciens)ZD-708菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCCNO.18644。本专利技术还提供菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)在生产中性蛋白酶中的应用。进一步地，采用菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)发酵生产中性蛋白酶的方法如下：将菌种按接种量5％-8％接种至发酵培养基中，置于200rpm-220rpm，35-37℃摇床中，培养80-90h。取发酵液经8000rpm，离心5min，测定上清的中性蛋白酶酶活为20200-21930U/ml，经测定上清中的蛋白含量为95-100mg/mL。发酵培养基组成为：麦芽糊精32g/L，玉米粉14g/L，豆饼粉12g/L，酵母粉2.3g/L，Na2HPO44.4g/L，KH2PO45.1g/L，碳酸钙1％，pH7.0。菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)可在25-65℃，pH4.5-8.5的条件下生长；其最适的生长温度为30-48℃，最适生长pH5.0-8.0。运用该菌种较宽的温度和pH适应性，可高效表达各种酸性、碱性、高温和低温不同特性的酶制剂，且利用该菌株表达普鲁兰酶时，蛋白表达水平可达到95-118mg/mL，能大幅度的降低生产成本，促进所表达的酶制剂在更多行业中的应用。本专利技术还提供菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)在作为高效分泌表达外源蛋白表达系统中的应用；进一步地，可通过替换菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)中的中性蛋白酶基因APR，来实现目标产物的表达；所述中性蛋白酶基因APR的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。有益效果：利用本专利技术所构建的解淀粉芽孢杆菌ZD-708(ΔGAΔEGL)经过突变后其限制修饰系统对pKS1质粒的剪切修饰已失效，作为中性蛋白酶的生产菌株可高效分泌表达中性蛋白酶，发酵培养中获得的中性蛋白酶酶活为20200-21930U/ml，经测定上清中的蛋白含量为95-100mg/mL，所表达的蛋白酶活水平高，大大降低了生产成本，拓宽了酶的应用领域，加速了相关行业新旧动能的转换，促进了相关行业经济的高质量发展。附图说明：图116SrRNA的PCR产物的电泳检测其中，M为Marker，1为样品；图2质粒pKS1的部分图谱；图3糖化酶基因敲除的电泳检测其中，M为Marker，1为样品；图4纤维素酶基因敲除的电泳检测其中，M为Marker，1为样品；具体实施方式：以下通过具体实施案例对本专利技术做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本专利技术实施范围的限定。实施例1中性蛋白酶高产菌株的筛选及鉴定1、菌株初筛采集沂水县食品工业园区土样，并将采集到的土样用研钵研细；取5g研细的土样放入装有95ml无菌水的大三角瓶中充分震荡，得到土壤悬浮液；将所述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；选择浓度为10-6、10-7和10-8的土壤悬浮液，取100μl加入SX培养基平板上，并涂布均匀，37℃的培养箱中培养1-3天；挑选有透明圈且大的单菌落再次划线于SX培养基平板上，进行二次确认和分离纯化，37℃，培养1-3天，得到分离纯化后的单菌落，取单菌落接种于装有5mLSX液体培养基的试管中，置于摇床中37℃，200rpm，培养1-2天，取菌悬液1mL和灭菌后的40％甘油1mL于5mL离心管中，置于-20℃的冰箱中保存备用。平板筛选的SX培养基组成为：胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾0.12g/L，氯化钙0.15g/L，硫酸镁2.2g/L，葡萄糖3.6g/L，脱脂奶粉1.7g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，磷酸氢二钠0.96g/L，琼脂粉10g/L，pH7.0。液体SX培养基为上述培养基中不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高效分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciens)ZD-708(ΔGAΔEGL)，是在ZD-708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得；/n所述ZD-708菌株，保藏号为CGMCC NO.18644。/n

【技术特征摘要】
1.一株高效分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacilluseamyloliquefaciens)ZD-708(ΔGAΔEGL)，是在ZD-708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得；
所述ZD-708菌株，保藏号为CGMCCNO.18644。


2.如权利要求1所述的高效分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述糖化酶基因GA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；
所述纤维素酶基因EGL的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示。


3.权利要求1所述菌株解淀粉芽孢杆菌(B...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文龙，王兴吉，郭庆文，王克芬，王金余，钱娟娟，佟新伟，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37