一株产铁载体的氢氧化细菌及其分离方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种节细菌属Arthrobacter 201‑9，该菌株分离于陕西省咸阳市双照镇白良村、白良寨村和雷家村大豆田，基于生理生化特性和16SrDNA分析被归为节细菌属细菌。本发明专利技术以大豆根际土壤为研究对象，利用气体循环培养体系从中分离氢氧化细菌，利用气相色谱法检测得到的菌株是否含有吸氢酶，对筛选出的含吸氢酶菌株做形态特征、生理生化特征及16SrDNA鉴定，结合以上实验结果确定菌株种属。对筛选出的吸氢酶阳性菌株的产IAA和产铁载体等促生特性进行研究，了解氢氧化细菌的促生机制，为“氢肥”理论提供理论依据。

A hydrogen oxidizing bacteria producing iron carrier and its separation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一株产铁载体的氢氧化细菌及其分离方法和应用
本专利技术涉及一株氢氧化细菌201-9及其分离方法和应用，具体涉及一种不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌节细菌属201-9（Arthrobactersp.201-9）及其微生物菌剂。该菌株于2018年9月19号保藏于武汉大学中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCCM2018637。该菌能够促进植物生长，属于微生物

技术介绍
轮作、间作是两种应用广泛的农业措施，在农业栽培方式中占有重要的地位。作物的轮作与间作最早可追溯到2000多年前的汉朝，而其广泛的应用到实际农业生产中是在魏晋南北朝。作物的轮作、间作可以改善土壤的化学成分和物理结构、增加土壤微生物多样性、均衡营养元素分布、提高土壤肥力。作物的轮作、间作，特别是应用豆科作物的轮作、间作的效益，被归结于种植豆科作物后，土壤中剩余氮的作用。然而有研究发现，此轮作效益只有约25%的增产效益来自于豆科作物残留的作用。董忠民教授通过研究发现，豆科作物固氮过程中释放的H2对作物的生长有促进作用，于2001年提出了“氢肥理论”。氢氧化细菌是一类依赖于豆科植物共生固氮释放的H2而生长的细菌，对作物的生长有促进作用。开展对氢氧化细菌的研究，探究氢氧化细菌的分离方法、获取新的菌种、促生机制，必将为农业的持续发展提供新的思路。土壤是农业生产的基础条件，在农业的可持续发展中发挥着不可替代的作用。随着我国城市化进程加快，经济增长迅速，人口数量不断增加，人均耕地面积逐年下降，为保证人们所需，必须增加农作物产量。长期以来人们为追求短期的增产效益而大量使用化肥，从而导致土壤板结，肥力下降，生态系统破环，农作物减产。自此，人们开始寻找新的方法来维持农业的可持续发展，提高作物的产量。根际促生菌对植物根系的生长发育、营养物质的吸收、病虫害的控制等方面都有重要的作用，因此通过调节植物根际促生菌的数量来调高作物的产量，保证产品的安全优质已经越来越受到人们的关注，PGPR的研究已经成为国际上的研究热点。氢氧化细菌是一类依赖于H2而生长的菌群，可以回收豆科植物固氮过程中的能量浪费，且是一类PGPR，因此研究氢氧化细菌对农业生产具有重要的价值。目前，在美国、加拿大、奥地利、澳大利亚等国家的少数几个实验室已经验证了H2对植物生长的促进作用，并分离得到氢氧化细菌。但是国内关于氢氧化细菌的研究尚未深入，相关的报道也很少。如果将依赖豆科植物共生固氮产生的H2而生长的氢氧化细菌应用到现代农业生产中，可以实现应用成本低廉的肥料，改善土壤肥力，提高作物产量的愿望，从而改善农民生活，提高区域经济，减少环境污染，维持农业可持续发展，实现资源能源优化配置。而且对土壤微生物多样性研究，开发新的微生物资源，提高作物产量，维持土壤肥力等方面的意义非常重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株氢氧化细菌201-9及含有氢氧化细菌201-9或由其产生的次级代谢物的环境亲和性氢氧化细菌制剂。本专利技术的另一目的是提供上述氢氧化细菌的分离培养方法以及促生特性。本专利技术实现过程如下：一种氢氧化细菌201-9，其分类命名为氢氧化细菌节细菌属201-9（Arthrobactersp.201-9），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M2018637。该菌株的生态学特征如下：球状，小，白色，边缘整齐，湿润，革兰氏阳性。上述氢氧化细菌201-9的分离方法，包括以下步骤：（1）样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；（2）土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H2的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；（4）优势菌种筛选：通过采用气相色谱法检测菌株氧化氢气的能力，筛选优势氢氧化细菌菌株；（5）筛选产IAA和铁载体的菌株：将筛选出的氢氧化细菌进行产IAA测定，筛选产IAA优良菌株；采用双层CAS平板法筛选产铁载体阳性菌株。上述氢氧化细菌201-9的分离方法，其中步骤(3)所述的矿质盐培养基组成为：K2HPO42.0g，KH2PO41.0g，NaCl5.0g，(NH4)2SO45.0g，MgSO40.2g，CaCl20.01g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。上述氢氧化细菌201-9的分离方法，其中步骤(4)所述的气相色谱条件为：色谱柱为5A分子筛填充柱，载气为高纯N2，进样口温度：230℃；检测器温度：200℃；柱温箱温度：50℃；标准曲线的制作：用气相色谱检测600-3000ppm的氢气标气，绘制标准曲线。上述氢氧化细菌201-9的分离方法，其中步骤(5)所述双层CAS平板培养基，上层平板：溶液A，称取60.5mgCAS（络天青）溶解于10mL1MFeCl3溶液（FeCl3·6H2O溶于10MHCl），溶解后加入50mL蒸馏水混匀；溶液B，将72.9mgHDTMA（十六烷基三甲基溴化铵）在40mL蒸馏水中溶解得到B溶液；然后边搅拌A溶液边加入B液，最终形成CAS蓝色检测液后，加入蒸馏水使得检测液的体积为950mL，最后将50mL0.1M的磷酸缓冲液加入到该检测液中，并加入琼脂10g，121℃灭菌15min后放入50℃水浴锅中备用；磷酸缓冲液的配制方法如下：Na2HPO4·12H2O2.427g，NaH2PO4·2H2O0.5905g，KH2PO40.075g，NH4Cl0.250g，NaCl0.125g；pH6.8。下层平板：酪蛋白水解物5.0g，K2HPO42.5g，MgSO42.5g，甘油15mL，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，pH7.2。注意：配制双层CAS培养基时所有器皿都要做去铁敏处理。本专利技术的氢氧化细菌201-9为在28℃的MSA培养基中培养的革兰式阳性杆状细菌。其分离培养方法首先是利用气体循环培养体系来电解水产生H2，和泵入的空气形成混合气体，调节电流大小，使得混合气体的中H2的浓度为832ppm，使得通入混合气体的流速为280mL/min。利用涂布平板法将按浓度梯度稀释的土壤悬液涂布于矿质盐培养基上进行菌种分离，气相色谱检测菌株的H2消耗量，从而进一步筛选出H2消耗能力比较强的氢氧化细菌。而后从ACC脱氨酶、IAA、产铁载体等方面来研究其促生特性。其鉴定特征如下：1、生理生化特征菌株201-9的生理生化特征显示在表1所述菌株201-9呈球状，革兰氏染色阳性。在MSA半固体培养基上28℃培养可形成菌落，呈白色，边缘整齐，湿润。附注：1接触酶2水解淀粉3甲基红4V-P测定5纤维素水解6吲哚试验7脂酶8产氨9明胶液化10硝酸盐水解11亚硝酸还原2、序列分析将菌株送往西安擎科泽西生物技术有限公司进行菌种鉴定。菌种鉴定结果：除对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氢氧化细菌201-9，其分类命名为氢氧化细菌节细菌属201-9（

【技术特征摘要】
1.一种氢氧化细菌201-9，其分类命名为氢氧化细菌节细菌属201-9（Arthrobactersp.201-9），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M2018637。


2.根据权利要求1所述的氢氧化细菌201-9，其生态学特征如下：球状，小，白色，边缘整齐，湿润，革兰氏阳性。


3.权利要求1所述氢氧化细菌201-9的分离方法，包括以下步骤：
（1）样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；
（2）土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H2的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；
（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；
（4）优势菌种筛选：通过采用气相色谱法检测菌株氧化氢气的能力，筛选优势氢氧化细菌菌株；
（5）筛选产IAA和铁载体的菌株：将筛选出的氢氧化细菌进行产IAA测定，筛选产IAA优良菌株；采用双层CAS平板法筛选产铁载体阳性菌株。


4.根据权利要求3所述氢氧化细菌201-9的分离方法，其特征在于，其中步骤(3)所述的矿质盐培养基组成为：K2HPO42.0g，KH2PO41.0g，NaCl5.0g，(NH4)2SO45.0g，MgSO40.2g，CaCl20.01g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。


5.根据权利要求3所述氢氧化细菌201-9的分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫卫，李璐璐，刘瑞瑞，李志英，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61