一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗技术方案

本发明专利技术属于疫苗技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗。该非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗的主要原料为非洲猪瘟融合蛋白，本发明专利技术的非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.1所示的序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.2所示的序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.3所示的序列。该非洲猪瘟融合蛋白具有免疫效果好等优点。

A genetically engineered vaccine targeting the immune system of African swine fever

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗
本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗。
技术介绍
非洲猪瘟(ASF)自2018年8月传入我国，现已严重影响了畜牧业的发展和人民的生活。该病从1921年被发现至今近百年，但目前全球尚无获批疫苗和特效药。随着现代生物学的发展，ASF疫苗研发取得了较大的研究进展。鉴于现有的研究，开发有效的灭活ASF疫苗似乎不太可能。现研发方向主要集中在减毒疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗以及核酸疫苗等。减毒活疫苗具有能有效激活机体免疫系统的优点，主要分为传统减毒和重组减毒活疫苗，但这两类疫苗都存着毒力返强的可能性，均不是高安全性的首选；尤其是传统减毒活疫苗，如使用不当可能会衍生出新的强毒。核酸疫苗可产生持久性的免疫应答，但目前安全性及有效性无法保证。病毒活载体疫苗相对于减毒活疫苗虽较安全，但现阶段还缺乏对其长期安全性、有效性的研究，且活载体疫苗多采用细胞表达，成本高。亚单位苗包括：传统方式是采用微生物培养后用物理和化学方法提取有效抗原成分制成疫苗；现代生物学方法是将病原的基因和蛋白进行分析后，利用基因工程技术将病原保护性抗原基因序列插入合适的表达质粒，高效稳定表达，生产抗原制成亚单位疫苗。亚单位疫苗是公认最安全的疫苗，但ASFV编码多达170种蛋白质，因此很难选择可诱导保护的抗原，目前已经研究报道了几种ASFV蛋白是ASFV的中和位点，并对这些蛋白质的免疫保护能力做了测试。但由于不能很好地刺激细胞免疫以及中和位点中多个空间构象难以保持正确形态的问题，效果均不理想。非洲猪瘟疫苗研发的难点在于病毒基因组大，蛋白多，结构复杂，难大规模培养，传代易变异，病毒免疫逃逸机制不清，且毒株使用对研究硬件要求高。截至2019年9月1日，国内除农业部下属的哈尔滨兽医研究所有条件进行减毒、基因缺失苗的研发外，其他研究机构均缺少必要的研究硬件，亚单位苗的研发成为其他团队唯一可行的选择。而非洲猪瘟亚单位苗研发的难点在于如何有效的激活猪的细胞免疫、产生高水平的中和抗体并避免某些抗体加速病毒感染(ADE效应)。文献《NeutralizingantibodiestoAfricanswinefevervirusproteinsp30,p54,andp72arenotsufficientforantibody-mediatedprotection》J.G.Neilan等，《Virology》319(2004),P337-342)公开了用杆状病毒表达致病性ASFVPr4株的p30、p54、p72和p22蛋白免疫猪，在免疫组动物中检测到ASFV特异性中和抗体，但用104TCID50剂量的Pr4攻毒，免疫组和对照组的所有动物在7-10DPI之间死亡，表明针对上述蛋白的中和抗体不足以进行抗体介导的保护。中国专利文献CN103172749A公开了一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备，该非洲猪瘟蛋白工程疫苗通过利用基因重组技术，将非洲猪瘟重要结构蛋白p72、p54以及红细胞凝集素HA多个T细胞表位和纯化标签串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备得到具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，用于非洲猪瘟疫情的防控。该蛋白不含有目前主流研究公认的重要抗原P30，在免疫时，理论上存在保护抗体谱窄的问题。另外，重组蛋白对体液免疫刺激不足的问题也没有通过设计进行解决，存在一免后抗体效价较低的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种非洲猪瘟融合蛋白，该非洲猪瘟融合蛋白用于制作疫苗时，免疫效果更好，以解决现有技术中亚单位疫苗免疫效果差的问题。本专利技术的非洲猪瘟融合蛋白采用如下技术方案：一种非洲猪瘟融合蛋白，所述非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。优选的，所述非洲猪瘟蛋白还包括T细胞激活表位，所述T细胞免疫激活表位包括但不限于Np147-155(氨基酸序列为TYQRTRALV)。T细胞免疫激活表位有助于被免疫动物细胞免疫应答的产生，从而可解决亚单位疫苗诱导低或无细胞免疫应答的难题。作为上述2项技术方案的进一步优选的方案，所述非洲猪瘟融合蛋白还包括巨噬细胞靶向表位，所述巨噬细胞靶向表位包括但不限于Tuftsin(氨基酸序列为TKPR)。巨噬细胞靶向表位可提高免疫细胞抗原摄入效率，克服亚单位疫苗免疫原性差的缺点，诱导机体快速、高效产生中和抗体。优选的，所述非洲猪瘟融合蛋白还包括柔性连接臂和/或纯化标签。优选的，所述柔性连接臂的氨基酸序列选自KK或/和GGGSGGG；所述纯化标签的氨基酸序列为HHHHHH。优选的，所述非洲猪瘟融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4-7中任意一项所示。本专利技术的第二目的在于提供上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白的制备方法，具体技术方案为：采用基因工程的方法，通过原核表达系统表达非洲猪瘟融合蛋白。本领域技术人员应当得知，除原核表达系统外，还可通过真核表达系统或化学合成法按照本专利技术的融合蛋白的氨基酸序列制备上述非洲猪瘟融合蛋白。本专利技术的第三目的在于提供一种核酸，具体技术方案为：所述核酸编码如上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白。根据本领域常识，本领域技术人员可根据上述所公开的非洲猪瘟中和表位融合蛋白的氨基酸序列得到编码相应的氨基酸序列的核苷酸序列，进而获取所述核酸分子。本专利技术在制备所述非洲猪瘟中和表位融合蛋白的过程中，即通过向生物工程技术公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)提供所述非洲猪瘟中和表位融合蛋白的氨基酸序列，由上海生工根据所采用的不同表达系统，对密码子进行优化，并合成了相应的核苷酸序列和重组质粒(载体)。本专利技术的第四目的在于提供一种非洲猪瘟免疫系统基因工程疫苗，具体技术方案为所述疫苗的原料包括如上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白。应当说明的是，除所述非洲猪瘟融合蛋白外，所述疫苗还可包括赋形剂，载体或稀释剂等成分。进一步的，任选地包含一种或多种合适的佐剂，例如：201佐剂(法国赛比克公司)、化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。本专利技术的目的还在于提供了如上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白的用途，具体技术方案为：所述非洲猪瘟融合蛋白在制备非洲猪瘟单克隆抗体和非洲猪瘟检测试纸条或检测卡或试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术的非洲猪瘟融合蛋白利用p54、p72和p30蛋白的中和抗原表位精确定位，可有效防止抗体依赖(ADE)效应，且免疫效果好，首免后即可产生显著高于对照组(生理盐水)的体液和细胞免疫。其中，SEQIDNO.3不仅是p3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQ IDNO.1所示的序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.2所示的序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.3所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQIDNO.1所示的序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQIDNO.2所示的序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQIDNO.3所示的序列。


2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟蛋白还包括T细胞免疫激活表位，所述T细胞免疫激活表位包括但不限于Np147-155。


3.根据权利要求1或2所述的非洲猪瘟融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟融合蛋白还包括巨噬细胞靶向表位，所述巨噬细胞靶向表位包括但不限于Tuftsin。


4.根据权利要求1-3中任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟融合蛋白还包括柔性连接臂和/或纯化标签。


5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕胜利，王云龙，殷宏，常慧芸，范雪亭，李玉林，伊瑶，张怡青，王继创，宋长绪，王国强，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心，郑州倍赛泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41