哺乳动物角膜的脱细胞方法技术

本发明专利技术公开了一种哺乳动物角膜的脱细胞方法，包括预处理步骤和脱细胞步骤，所述预处理步骤包括清洗、刮净和削切，以获取厚度为200‑500μm的板层角膜，在经过所述脱细胞步骤包括冷冻、温融和脱除，以去除细胞，得到透明性好、结构致密，接近于人体角膜的自然特性的脱细胞角膜基质。本发明专利技术使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂，有利于保持角膜的微观结构。本发明专利技术将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后，再在等渗液中进行超声，有效缩短角膜与酶的接触时间，在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜基本结构得以保持。

Acellularization of mammalian cornea

【技术实现步骤摘要】
哺乳动物角膜的脱细胞方法
本专利技术属于组织工程
，具体涉及一种将哺乳动物角膜经过预处理和脱细胞等步骤制备得到脱细胞角膜的方法。
技术介绍
角膜病是引起角膜盲的第二大原因。其中80％的角膜病患者可通过角膜移植来避免致盲。然而，受我国传统文化的影响，角膜的捐献较少，导致于同种异体角膜供体匮乏，全国每年接受角膜移植的手术仅仅3000余例，而人工角膜的出现给角膜病患者带来了希望。最初的人工角膜停留在无机或有机材料加工而成的角膜替代物。但是这些材料无法模拟天然角膜的微观结构，生物相容性差，使其在临床使用推广中受限。随着组织工程学的兴起，人们将焦点集中在天然的动物角膜材料。利用脱细胞的方法去除异种角膜的外源细胞及抗原物质，从而获得异种无细胞的角膜细胞外基质材料。组织工程角膜材料在临床应用须要满足三个最基本的要求，一是异种角膜细胞被脱除的彻底性，二是角膜的透明度，三是角膜的生理弧度。组织工程角膜材料移植到患者身上时，如果异种细胞脱除不彻底，将产生免疫排斥反应，导致移植效果不佳；角膜材料移植后透明是最终目的，如果脱细胞过程中对微观结构破坏较大，移植后透明度恢复不好，依然影响患者视力，患者的生活并未得到改善；角膜削切手段会影响削切后板层的生理弧度，如果削切平整，弧度会很好的保留，而且切面的平整度将直接影响角膜移植的成功率以及移植后的恢复情况，以上均为临床应用须要考虑的重要因素。目前国内外学者对猪、牛、羊等哺乳动物角膜进行了大量的试验研究，但仍无法满足临床要求。目前常用的脱细胞方法包括化学法、物理法和生物酶法。常规单一的化学法或者物理法脱细胞需要长时间的作用才能达到脱细胞效果，且长时间的作用又会造成角膜胶原蛋白的微观结构破坏。专利文献201510074946.7(专利名称：一种人工角膜的制备方法)利用板层刀制备板层角膜，钻取指定大小的角膜片，通过冻融、超声联合核酸内切酶降解法进行脱细胞。该方法中利用板层刀获取板层角膜，无法保证切面的平整性，从而影响移植后与植床的贴合性，导致术后透明度的恢复。专利文献201410230365.3(专利名称：一种板层角膜基质支架及其制备方法)将动物角膜依次进行低渗溶胀、反复冻融、利用DNA酶和RNA酶的缓冲体系进行酶消化处理。专利文献201610080864.8(专利名称：利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法)将牛角膜浸泡在低渗溶液中，取出角膜上皮细胞得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，反复冻融后再用缓冲液漂洗，放入脱细胞试剂中浸泡脱细胞，再用超纯水对牛角膜基质进行冲洗，最后放入脱水剂中浸泡、灭菌，制得牛角膜基质。以上两件专利技术均使用了低渗溶液，这种溶液致使角膜易溶胀，对角膜基质结构破坏性较大，且未对脱细胞后的角膜进行孵育软化。
技术实现思路
针对现有技术的缺点和局限，本专利技术提供一种采用物理方法和低毒性试剂，制备得到透明性好、结构致密，接近于人体角膜的自然特性的脱细胞角膜基质的方法。该方法是广泛应用于哺乳动物角膜的脱细胞方法，包括预处理步骤和脱细胞步骤，所述预处理步骤包括清洗、刮净和削切；所述脱细胞步骤包括冷冻、温融和脱除。其中：清洗是指将获取的哺乳动物眼球用清洗液进行清洗，所述清洗液为含有抗生素的无菌PBS溶液；所述抗生素为医药领域已知的抗生素。刮净是指刮去角膜上皮层以使前弹力层暴露，以去除上皮层细胞。削切是指对清洗刮净后的角膜进行削切，本领域技术人员可以根据后续处理要求及临床使用需求确定板层角膜的厚度。申请人经过大量试验总结认为，当厚度为200-500μm时，既便于后续处理，又使制成的角膜能够满足临床使用需求。冷冻包括将角膜密封后置于液氮中5-60min；本领域技术人员可以根据角膜的具体数量选择冷冻所需的具体时长，冷冻时间过短可能起不到细胞冰冻结晶的目的，进而导致细胞破碎不彻底，冷冻时间过长可能导致角膜胶原纤维损伤，进而导致角膜基本结构难以恢复，并且生产成本增加。温融包括将冷冻后的角膜置于水浴中以使其解冻；解冻是指使被冷冻的角膜解冻变为类似冷冻前状态的过程。脱除包括先将温融后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理，再将角膜置于等渗液中进行超声处理。所述脱细胞试剂可以选用本领域现有技术中常用的脱细胞试剂，比如专利文献CN104001217A中公开的脱细胞试剂。在本专利技术非限制性的优选实施方式中，所述脱细胞试剂优选包含0.2-1.0％(w/v)中性蛋白酶和0.01-0.20％(w/v)EDTA或其钠盐；所述等渗液为：具有不会使角膜结构改变的渗透压参数的溶液；其中，中性蛋白酶的作用是破坏细胞结构，加速细胞的裂解，EDTA的作用是结合金属离子，破坏细胞对ECM的粘附，二者一起使用时，EDTA能够促进中性蛋白酶的脱细胞效果，并且有利于保持角膜胶原纤维基本结构不被破坏。在本专利技术非限制性的实施方式中，所述哺乳动物为猪。但本领域技术人员熟知，本专利技术提供的技术方案是针对角膜细胞进行的处理，与哺乳动物的细胞种类并无关系，只要是哺乳动物角膜细胞即可适用于此方法进行处理，进而制备得到透明性好、结构致密，接近于人体角膜的自然特性的脱细胞角膜基质。在本专利技术非限制性的实施方式中，密封是指将角膜置于密闭容器中加以密封，防止在冷冻过程中染菌污染。在本专利技术非限制性的实施方式中，所述密封是指将角膜置于密闭容器中加以密封，防止在冷冻过程中染菌污染。在本专利技术非限制性的优选实施方式中，所述抗生素为常规剂量的磷霉素和/或链霉素，优选剂量为磷霉素30-200万单位/L，链霉素30-200万单位/L。抗生素的作用是抑菌或杀菌，从而控制微生物的生长和繁殖。在本专利技术非限制性的上述实施方式中，通过冷冻使细胞被冷冻，通过温融使细胞解冻，冷冻和温融促使细胞破碎，进而有利于去除细胞。反复交替重复冷冻和温融，更有利于细胞破碎和去除，但重复次数过多将使角膜基本结构受到破坏。优选交替重复冷冻和温融1-5次。在本专利技术非限制性的上述实施方式中，所述脱除步骤包括将角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理，再将角膜置于等渗液中进行超声处理，先在脱细胞试剂中振荡，再在等渗液中超声，在温和的环境中脱除细胞，能够使角膜基本结构得以保持。重复脱除步骤更有利于细胞彻底脱除，但重复次数过多将使角膜基本结构受到破坏。优选重复脱除1-8次。在本专利技术非限制性的上述实施方式中，所述削切使用的工具优选飞秒激光仪。具体使用时可在飞秒激光机的交互界面设定厚度参数，进行激光切割获取板层角膜，厚度为200-500μm符合临床应用要求。飞秒激光切割具有脉冲窄、能量集中，热扩散时间短的特点，因而对角膜周围组织的损伤很小，而且削切边界清楚，削切面光滑，有利于临床使用时角膜基质与创面的贴合。在本专利技术非限制性的上述实施方式中，温融可将角膜放置常温空气中解冻，优选使用水浴解冻，水浴的温度过高将使角膜变性，温度过低则达不到使角膜细胞有效破碎的目的，所述水浴的优选温度是20-37℃。在本专利技术非限制性的上述实施方式中，除了水浴的温度，将冷冻后的角膜置于水浴中的持续时长也将影响角膜细胞的破本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.哺乳动物角膜的脱细胞方法，包括预处理步骤和脱细胞步骤，其特征在于：所述预处理步骤包括清洗、刮净和削切；所述脱细胞步骤包括冷冻、温融和脱除；/n所述清洗是指：将获取的哺乳动物眼球用清洗液进行清洗，所述清洗液为含有抗生素的无菌PBS溶液；所述刮净是指：刮去角膜上皮层以使前弹力层暴露，以去除上皮层细胞；所述削切是指：对清洗刮净后的角膜进行削切，以获取厚度为200-500μm的板层角膜；/n所述冷冻包括：将角膜密封后置于液氮中5-60min；所述温融包括：将冷冻后的角膜置于水浴中以使其解冻；所述脱除包括：先将温融后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理，再将角膜置于等渗液中进行超声处理；所述脱细胞试剂包含0.2-1.0％中性蛋白酶和0.01-0.20％EDTA；所述等渗液为：具有不会使角膜胶原纤维结构改变的渗透压参数的溶液。/n

【技术特征摘要】
1.哺乳动物角膜的脱细胞方法，包括预处理步骤和脱细胞步骤，其特征在于：所述预处理步骤包括清洗、刮净和削切；所述脱细胞步骤包括冷冻、温融和脱除；
所述清洗是指：将获取的哺乳动物眼球用清洗液进行清洗，所述清洗液为含有抗生素的无菌PBS溶液；所述刮净是指：刮去角膜上皮层以使前弹力层暴露，以去除上皮层细胞；所述削切是指：对清洗刮净后的角膜进行削切，以获取厚度为200-500μm的板层角膜；
所述冷冻包括：将角膜密封后置于液氮中5-60min；所述温融包括：将冷冻后的角膜置于水浴中以使其解冻；所述脱除包括：先将温融后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理，再将角膜置于等渗液中进行超声处理；所述脱细胞试剂包含0.2-1.0％中性蛋白酶和0.01-0.20％EDTA；所述等渗液为：具有不会使角膜胶原纤维结构改变的渗透压参数的溶液。


2.根据权利要求1所述的脱细胞方法，其特征在于：所述抗生素为医药领域已知的抗生素；优选为磷霉素和/或链霉素；优选剂量为磷霉素30-200万单位/L，链霉素30-200万单位/L。


3.根据权利要求1所述的脱细胞方法，其特征在于：所述削切使用的工具是飞秒激光仪。


4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海利，张晋南，宇咏梅，唐小琪，马百双，甘良波，
申请(专利权)人：深圳艾尼尔角膜工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44