新的CD73抗体、其制备和用途制造技术

本发明专利技术涉及改进的抗‑CD73抗体，与现有技术的抗‑CD73抗体相比，改进的抗‑CD73抗体结合具有促癌作用的膜结合形式的CD73蛋白并且抑制其酶活性，同时基本上不抑制参与心脏保护的可溶形式的CD73蛋白。本发明专利技术还涉及产生这种特异性抗‑CD73抗体的方法，以及其用途，包括作为药物的用途和在用于治疗、减轻、预防和诊断癌症的方法中的用途。

New CD73 antibody, its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的CD73抗体、其制备和用途本申请含有计算机可读形式的序列表，在此通过引用将其并入。专利
本专利技术涉及改进的抗-CD73抗体，与现有技术的抗-CD73抗体相比，改进的抗-CD73抗体结合具有促癌作用的膜结合形式的CD73蛋白并且特异性抑制其酶活性，同时基本上不抑制参与心脏保护的可溶形式的CD73蛋白。本专利技术还涉及产生这种特异性抗-CD73抗体的方法，以及其用途，包括作为药物的用途和在用于治疗、减轻、预防和诊断癌症的方法中的用途。因此，本专利技术的抗-CD73单克隆抗体具有作为用于作为单独的治疗或者与阿霉素组合治疗癌症(例如，AML，ALL)和其他免疫介导疾病的免疫检查点抑制剂的新药潜力。
技术介绍
对于引起较少严重不良副反应的有效的癌症疗法存在有重大医疗需求。目前的疗法通常缺乏特异性，而且常常由于针对化疗和放疗的固有或获得性耐受性而失效。外核苷酸酶CD73是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的膜结合糖蛋白，其将细胞外一磷酸腺苷(AMP)转化成腺苷(ADO)。可溶形式的CD73可以通过GPI锚的溶蛋白性裂解或水解从膜脱落。CD73是ATP衰变为腺苷的限速酶，其发挥不同的促癌作用机制。该分子表达于免疫效应细胞上，在该处其有助于免疫抑制作用和低反应性(hyporesponsiveness)；另外，也跨许多种类型的癌症而得以高水平表达。CD73也见于许多种组织中，包括结肠、脑、肾、肝、肺和心脏，另外还见于白血球上以及内皮上。存在着该酶的表达和功能在缺氧条件下以及通过若干促炎介质的存在而上调的证据。在肿瘤微环境内，CD73产生的腺苷促进肿瘤的生长和存活，同时抑制抗肿瘤的免疫应答。经发现，CD73在范围广泛的癌细胞中得到过量表达，阻断该酶已经显示改变肿瘤的免疫抑制能力。癌细胞诱导免疫抑制环境促进其自身的生长，并规避免疫识别。因此，CD73(也称作NT5E)是强有力的免疫抑制剂。CD73是胞外酶，通常在内皮细胞和免疫细胞上表达，在该处其有助于免疫平衡。例如，CD73在Treg活性的调节(Deaglioetal.，2007；Wangetal.，2011)和无变应性T细胞的低反应性(Martinezetal.，2012)中发挥中心作用。因此，具有EC3.1.3.5酶活性的CD73(或胞外-5’-核苷酸酶或5’-NT)是广泛表达的催化一磷酸腺苷去磷酸化为腺苷的胞外酶，其发挥不同的免疫抑制和促癌作用机制(图1)。该分子在免疫效应细胞上组成型表达或诱导，在该处有助于免疫抑制作用和低反应性。另一方面，CD73跨许多种类型的癌症而过量表达(Staggetal.，2013)，通常与临床预后差有关(Renetal.，2016)。免疫抑制肿瘤环境含有高水平ADO，靶向CD73阻断通过减少ADO积累来促进抗肿瘤免疫力。在癌症中，CD73推测发挥双重功能：一是，它在构成肿瘤性微环境的肿瘤浸润间质细胞上表达并发挥酶活性；其次，它在癌细胞上高度表达，并直接刺激其以自分泌的方式生长(Staggetal.，2010；Staggetal.，2012)。此外，CD73活性使肿瘤特异性T细胞反应迟钝(Jinetal.，2010)，并干扰细胞凋亡和转移(Antoniolietal.，2013)。事实上，多个临床前模型已经证明了CD73作为癌症治疗的治疗靶点的价值(Zhang，2010)。因此，已经表明抗-CD73mAb在动物模型中降低肿瘤的生长和转移(Staggetal.，2010)。CD73过量表达还与癌细胞的耐药性有关，癌细胞包括乳腺癌(Loietal.，2013)、结直肠癌(Cushmanetal.，2015)和成胶质细胞瘤(Quezadaetal.，2013)等等。尤其是，CD73还被发现在针对TRAIL-诱导的细胞凋亡有耐受性的白血病细胞中过量表达(Mikhailovetal.，2008)。目前，正朝着单独地或者与其他检查点抑制剂组合用抗体进行抗-CD73疗法的临床转化而努力。CD73-阻断mAb构成有价值的抗癌工具，其可以成为放化疗、分子靶向疗法和其他免疫治疗策略的组成部分。出于这些原因，CD73被视作是有前景的用于例如用阻断单克隆抗体(mAb)进行免疫疗法(辅助)策略的分子靶标。但是，通过常规的免疫技术，极难获得针对结构上复杂的膜蛋白质(如G-蛋白偶联受体(GPCR))或膜结合(membrane-tethered)酶(如CD73)的功能性且由此具有构象特异性的mAb。另一方面，可溶形式的CD73可以通过GPI锚的溶蛋白性裂解或水解从膜脱落，已经报道具有心脏保护作用。因此，阻断可溶形式的CD73是不合意的，以避免潜在的心脏相关的副作用。而且，由于细胞中的CD73蛋白大多数以膜结合形式存在，这些膜结合的形式构成癌症治疗中用于CD73失活的主要靶标形式。现有技术中已知有若干抗-CD73mAb(WO2016081748)，但是，其无一能够特异性地抑制膜结合形式的CD73蛋白、同时基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性。通过提供基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白、同时抑制膜结合形式的CD73的酶活性的抗体，如本文在以下所述，本申请满足了这一需求，上述抗体在权利要求中说明其特征，并通过所附的实施例和附图说明。细胞外囊泡(EV)是细胞(包括癌细胞)释放的膜围绕的囊泡，含有其来源细胞的功能性蛋白质。EV很有可能构成囊泡如外来体(exosome)和微囊泡的混合物，上述囊泡在形态发生路径、其组成并可能在其生物功能方面有所不同。EV在膜和膜蛋白质中富含，已经表明发挥多种免疫作用。而且，EV在其生理构象中载有多种膜蛋白质。但是EV还含有多种类别的功能性核酸，其在EV被目标细胞吞没之后可以被翻译成功能性蛋白质(在mRNA的情形中)或者发挥调节功能(在例如微-RNA的情形中)。因此，EV现如今被视作是(复杂)信息从来源细胞到目标细胞的相关且强有力的传送者。本专利技术的专利技术人开发了涉及源自肿瘤的EV的免疫策略，用以产生具有治疗和/或诊断潜力的单克隆抗体(mAb)。使用该策略，专利技术人生成了称作“22E6”的单克隆抗体，该抗体基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白，使得其可以主要产生参与心脏保护的腺苷，但与膜结合形式的CD73蛋白结合，并特异性地抑制其酶活性。该22E6mAb在此预计是优越的用于干扰癌症耐受性、并进一步临床用于单一和组合疗法的分子。而且，因可溶形式的CD73得以报道的在心脏保护中的作用，阻断其是不合意的，因此相对于现有的结合并抑制可溶和膜结合两种形式的CD73的CD73单克隆抗体，22E6mAb是特别有利的。根据本专利技术的22E6mAb的序列清楚地不同于已知抗体的序列。因此，22E6mAb是首个且唯一的选择性抑制膜结合的CD73、但不抑制可溶形式的CD73的抗体。考虑到这两种形式的分子在结构上类似，不同之处仅在于存在还是不存在GPI-锚，开发出选择性地阻断膜形式的功能性抗体是全新且预料不到的。
技术实现思路
本专利技术涉及抗-CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗-CD73抗体或其抗原结合部分表现出以下特性中的一种或多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗-CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗-CD37抗体或其抗原结合部分表现出以下特性中的一种或多种：/ni)特异性抑制膜结合形式的CD73的酶活性；/nii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中抑制膜结合形式的CD73的酶活性；/niii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中结合膜结合形式的CD73蛋白并抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170523 LU LU1002651.一种抗-CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗-CD37抗体或其抗原结合部分表现出以下特性中的一种或多种：
i)特异性抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
ii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
iii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中结合膜结合形式的CD73蛋白并抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。


2.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述酶活性是EC3.1.3.5。


3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分增加混合淋巴细胞反应中的TNFα释放。


4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述膜结合形式的CD73蛋白位于癌细胞或源自所述癌细胞的细胞外囊泡(EV)上。


5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体。


6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其包含以下多肽中的一个或多个：
i)与SEQIDNO：9所示的VH区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
ii)与SEQIDNO：10所示的H-CDR1多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
iii)与SEQIDNO：11所示的H-CDR2区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
iv)与SEQIDNO：12所示的H-CDR3区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
v)与SEQIDNO：13所示的VL区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
vi)与SEQIDNO：14所示的L-CDR1区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
vii)与SEQIDNO：15所示的L-CDR2区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
viii)与SEQIDNO：16所示的L-CDR3区多肽序列的同一性为至少60％或更高的多肽；
ix)在与SEQIDNO：9的31位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽；
x)在与SEQIDNO：9的42位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽；
xi)在与SEQIDNO：9的53位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽；
xii)在与SEQIDNO：9的61位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽；
xiii)在与SEQIDNO：9的84位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽；
xiv)在与SEQIDNO：9的85位对应的位置处具有氨基酸S的重链可变区多肽；
xv)在与SEQIDNO：9的86位对应的位置处具有氨基酸L的重链可变区多肽；
xvi)在与SEQIDNO：9的90位对应的位置处具有氨基酸E的重链可变区多肽；
xvii)在与SEQIDNO：9的105位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽；
xviii)在与SEQIDNO：9的106位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽；
xix)在与SEQIDNO：9的107位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽；
xx)在与SEQIDNO：9的108位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽；
xxi)在与SEQIDNO：9的109位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽；
xxii)在与SEQIDNO：9的110位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽；
xxiii)在与SEQIDNO：9的111位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽；
xxiv)在与SEQIDNO：9的115位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽；
xxv)以下重链可变区多肽：使用SEQIDNO：9的编号，在与SEQIDNO：9的31位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQIDNO：9的42位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQIDNO：9的53位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQIDNO：9的61位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQIDNO：9的84位对应的位置处具有氨基酸D；在与SEQIDNO：9的85位对应的位置处具有氨基酸S；在与SEQIDNO：9的86位对应的位置处具有氨基酸L；在与SEQIDNO：9的90位对应的位置处具有氨基酸E；在与SEQIDNO：9的105位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQIDNO：9的106位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQIDNO：9的107位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQIDNO：9的108位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQIDNO：9的109位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQIDNO：9的110位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQIDNO：9的111位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQIDNO：9的115位对应的位置处具有氨基酸D；
xxvi)如i)中所定义的多肽，还在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸；
xxvii)如ii)中所定义的多肽，还在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸；
xxviii)如iii)中所定义的多肽，还在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸；
xxix)如iv)中所定义的多肽，还在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸。


7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下中的一个或多个：
i)在其重链可变区中，H-CDR1，如SEQIDNOs：10所示；
ii)在其重链可变区中，H-CDR2，如SEQIDNOs：11所示；
iii)在其重链可变区中，H-CDR3，如SEQIDNOs：12所示；
iv)在其重链可变区中，H-CDR1和H-CDR2，如SEQIDNOs：10和11所示；
v)在其重链可变区中，H-CDR1和H-CDR3，如SEQIDNOs：10和12所示；
vi)在其重链可变区中，H-CDR2和H-CDR3，如SEQIDNOs：11和12所示；
vii)在其重链可变区中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，如SEQIDNOs：10、11和12所示；
viii)在其轻链可变区中，L-CDR1，如SEQIDNOs：14所示；
ix)在其轻链可变区中，L-CDR2，如SEQIDNOs：15所示；
x)在其轻链可变区中，L-CDR3，如SEQIDNOs：16所示；
xi)在其轻链可变区中，L-CDR1和L-CDR2，如SEQIDNOs：14和15所示；
xii)在其轻链可变区中，L-CDR1和L-CDR3，如SEQIDNOs：14和16所示；
xiii)在其轻链可变区中，L-CDR2和L-CDR3，如SEQIDNOs：15和16所示；
xiv)在其轻链可变区中，L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，如SEQIDNOs：14、15和16所示；
xv)在其重链可变区中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，如SEQIDNOs：10、11和12所示；和在其轻链可变区中，L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，如SEQIDNOs：14、15和16所示；
xvi)在其重链可变区中，如SEQIDNO：9所示的VH区序列；
xvii)在其轻链可变区中，如SEQIDNO：13所示的VL区序列；
xviii)在其重链可变区中，如SEQIDNO：9所示的VH区序列；和在其轻链可变区中...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·蔡德勒，B·冯诺贝克，R·菲德勒，S·浩克，
申请(专利权)人：德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE