用于降低嵌合Notch受体的免疫原性的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及降低嵌合Notch受体的免疫原性的方法和组合物，并具体涉及对于控制通过此类嵌合Notch受体递送至组织的基因表达有用的转录因子。

Methods and compositions for reducing immunogenicity of chimeric Notch receptors

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于降低嵌合Notch受体的免疫原性的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2017年6月19日提交的美国临时专利申请序列号62/603,993和2017年9月11日提交的美国临时专利申请序列号62/556,765的优先权，其两者在此通过引用整体并入。
本专利技术涉及分子生物学，并具体涉及用于降低某些受体的免疫原性的方法和组合物以及它们的应用，所述受体对控制单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞中的选择性基因表达有用。背景限制人类基因疗法的发展的重要问题是治疗性基因表达的调节，使得基因表达或用于实现表达的媒介物不会产生导致宿主排斥的增强的免疫原性。实现基因表达的一种方式描述于美国专利号9,670,281和Roybaletal.,Cell,Feb.11,2016中。描述了使用嵌合North受体的基因表达的激活。Notch受体是介导细胞-细胞接触信号传导并在发育和两个接触细胞之间的细胞对细胞通信的其他方面发挥核心作用的单次跨膜蛋白，所述两个接触细胞中的一个接触细胞具有Notch受体，并且另一个接触细胞是在其表面展示与相应的Notch受体结合的配体的细胞。天然Notch和它的天然配体Delta的接合导致Notch受体的两步蛋白水解，其最终引起该受体的细胞内部分从膜释放到细胞质中，在细胞质中它移动至细胞核。在那里，释放的结构域通过作为转录调节物发挥作用来改变细胞行为。Notch受体参与并对于发育期间的多种细胞功能是必需的，并且对于物种间众多细胞类型的功能至关重要。美国专利号9,670,281中描述了嵌合Notch受体，其显示Notch表达细胞可以在细胞表面上具有一个或多个不同的结合部分，仅举几例，例如scFV、纳米抗体、单链T细胞受体，所述结合部分识别与细胞相关联的配体最终引起受体的细胞内转录调节部分从膜释放到细胞质中，导致转录调节。然后将携带遇到其特异性靶抗原的嵌合Notch受体的工程化细胞切割，使得它们的胞质片段自由易位到细胞核中，以调节在合成启动子的控制下的任何开放阅读框(ORF)的转录。表达的ORF可以是局部诱导和募集免疫活性到靶抗原检测位置的细胞因子。进一步地，表达的ORF可以是嵌合抗原T细胞受体(CAR-T)，其仅在检测到由嵌合Notch受体检测到的引发靶抗原(primingtargetantigen)后靶向单独的、不同的靶抗原用于靶细胞杀伤。这使得高度特异性组合抗原模式识别能够允许在患病或癌细胞与健康细胞之间进行更好的区分。这可以极大地使工程化CAR-T细胞的应用能够安全地靶向更广范围的肿瘤，对健康组织的副作用更小。迄今为止，在嵌合Notch构建体中使用的转录机器是GAL4-VP16。由于DNA结合片段GAL4是酵母源，并且VP16是单纯疱疹病毒蛋白的高度酸性部分，因此GAL4-VP16具有高度免疫原性，并因此限制了嵌合Notch受体用于治疗人类疾病的用途。在用于实体瘤的许多基于免疫疗法的方法(包括细胞疗法)的功效的另一个主要障碍是在实体瘤中药物的递送或免疫细胞的激活。单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞构成浸润到实体瘤中的免疫细胞的主要成分(Longetal.,Oncoimmunology2:e26860,2013doi:10.4161/onci26860)。因为这些细胞类型被积极募集并保留在实体瘤中，所以它们可以是用于基因疗法递送的重要细胞类型。由于巨噬细胞中HIV-1感染的抑制，使用临床批准的载体(例如基于HIV-1的慢病毒)的巨噬细胞的基因工程一直是困难的。Hrecka等人(“VpxrelievestheinhibitionofHIV-1infectionofmacrophagesmediatedbytheSAMHD1protein,”Nature474(7353):658-661,2011)证明在HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒中发现的病毒粒子相关Vpx辅助蛋白的添加通过巨噬细胞限制因子SAMHD1的降解来减轻巨噬细胞的HIV-1感染的抑制。随后，已经证明单核细胞衍生的巨噬细胞可以用编码来自巨噬细胞的生产细胞因子的Vpx+慢病毒有效转导，旨在调节肿瘤微环境(Moyesetal.,HumanGeneTherapy28(2):200-215,2017)。
技术实现思路
本专利技术涉及用于降低嵌合Notch受体的免疫原性的方法和组合物。本文描述的Notch受体可以在单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞中进行基因工程化改造。本专利技术的另一个实施方案涉及通过人源化转录因子来降低嵌合Notch受体的免疫原性的方法和组合物，所述转录因子对控制通过嵌合Notch受体递送至组织的基因表达有用。在本专利技术的另一个实施方案中的是通过人源化转录因子来降低嵌合Notch受体的免疫原性的方法和组合物，所述人源化转录因子用于在含有所述嵌合Notch受体的细胞中表达基因，其中此类转录因子包含来自肝细胞核因子(HepatocyteNuclearFactor)转录因子家族的转录因子。本专利技术还涉及HNF1转录因子(例如HNF1alpha和vHNF1beta)的DNA结合结构域(DBD)用于生成具有降低的免疫原性的嵌合转录因子的用途，其对于将具有嵌合Notch受体的转基因递送至优选不表达内源性HNF1或vHNF1的组织有用。美国专利申请号200301096678。本专利技术的另一个实施方案是人HNF1DNA结合结构域，其与人转录激活物(TAD)或阻遏物结构域以及任选地人调节结构域结合使用。本专利技术的另一个实施方案是人HNF1DNA结合结构域，其与衍生自WWTR1(TAZ)蛋白的人转录激活物结构域(TAD)结合使用。本专利技术的另一个实施方案是人HNF1DNA结合结构域，其与衍生自CREB3(LZIP)蛋白的人转录激活物结构域(TAD)结合使用。本专利技术的另一个实施方案是人HNF1DNA结合结构域，其与衍生自NF-κB系统因子p65(RelA)的人转录激活物结构域(TAD)结合使用。本专利技术还涉及核酸分子和蛋白质，其对在真核细胞和生物体中使用具有低免疫原性的嵌合Notch受体调节基因的表达有用。本专利技术进一步提供了低免疫原性嵌合Notch受体多肽、包含编码嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸以及用核酸进行基因修饰的宿主细胞，其中通过包含人HNF1DNA结合结构域的转录因子与衍生自NF-κB系统因子p65(RelA)人转录激活物结构域(TAD)结合使用来实现低免疫原性。在本专利技术的一个具体实施方案中，人源化嵌合notch受体由以下序列，5’至3’组成：-人CD8a信号肽1-22(NP_001139345氨基酸1-22，(MALPVTALLLPLALLLHAARPS)(SEQIDNO:1))-指导蛋白质表达到细胞表面。-Myc标签(EQKLISEEDL)(SEQIDNO:2)–用于表面表达的合成受体的抗体标记的肽标签。Myc抗体：CellSignalingTechology，Myc标签(9B11)小鼠mAb(Alexa647Conjugate；CatalogueNo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含编码嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸，所述嵌合Notch多肽从N末端到C末端并以共价连接的方式包含：a)包含特异性结合抗原的结合剂的细胞外结构域；b)包含一个或多个蛋白水解切割位点的所述受体多肽；c)包含转录调节物的细胞内结构域，其中所述结合剂与所述抗原的结合诱导在所述一个或多个蛋白水解切割位点的所述Notch受体多肽的切割，由此释放所述细胞内结构域和所述转录调节物，并且其中所述转录调节物包含人源的DNA结合结构域和人源的转录激活结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170619 US 62/603,993;20170911 US 62/556,7651.包含编码嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸，所述嵌合Notch多肽从N末端到C末端并以共价连接的方式包含：a)包含特异性结合抗原的结合剂的细胞外结构域；b)包含一个或多个蛋白水解切割位点的所述受体多肽；c)包含转录调节物的细胞内结构域，其中所述结合剂与所述抗原的结合诱导在所述一个或多个蛋白水解切割位点的所述Notch受体多肽的切割，由此释放所述细胞内结构域和所述转录调节物，并且其中所述转录调节物包含人源的DNA结合结构域和人源的转录激活结构域。


2.如权利要求1中所述的核酸，其中所述结合剂包含抗体。


3.如权利要求2中所述的核酸，其中所述抗体选自下组：scFv、双特异性抗体、纳米抗体或bite。


4.如权利要求3中所述的核酸，其中所述转录调节物为转录激活物。


5.如权利要求3中所述的核酸，其中所述转录调节物为转录阻遏物。


6.如权利要求1中所述的核酸，其中所述转录调节物来自HNF转录调节物家族。


7.如权利要求6中所述的核酸，其中所述转录调节物为HNF1alpha或HNF1beta。


8.如权利要求7中所述的核酸，其中所述转录激...

【专利技术属性】
技术研发人员：A吉尔伯特，V斯勒普希金，P埃姆塔格，A列夫斯卡雅，S斯科特，
申请(专利权)人：细胞设计实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US