一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，属于分子生物学领域。该标记方法包括以下步骤：S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定。该方法简易、高效、条带易读、价格低廉，可大大提高分子标记辅助选择在木薯育种中的实用性及高效性。

A snap molecular marker method for identifying the color of cassava meat

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法。
技术介绍
木薯(ManihotEsculentaCrantz)是大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)植物，耐旱抗贫瘠，广泛种植于非洲、美洲和亚洲等100余个国家或地区，是世界三大薯类作物之一，热区第三大粮食作物，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”。木薯用途广泛，可应用于淀粉生产、工业使用和食用，尤其是在一些非洲国家。根据木薯块根中类胡萝卜素的类型，其块根肉质颜色可以从白色到粉色、淡黄色和黄色不等。白肉木薯块根对于淀粉工业很重要，但富含类胡萝卜素的黄肉块根对于直接将其作为主食食用的人来说，是减少维生素A缺乏的关键因素。同时，木薯中类胡萝卜素对延缓采后生理恶化(PPD)也很重要，可降低因PPD导致的经济损失。到目前为止，木薯育种策略主要集中为资源引进与系统选育，杂交或实生种选育，但育种周期相对较长，效率低下，分子标记辅助育种为木薯品种选育或资源筛选提供了一条高效的途径。研究表明，木薯块根的肉质颜色是由参与类胡萝卜素生物合成的基因PSY2的SNP位点改变造成的。PSY2中的等位基因特异性单核苷酸多态性(SNP)导致氨基酸序列的变化，导致块根颜色从白色变为黄色。当SNP位点为碱基C时，块根肉质颜色为白色，当SNP位点为碱基A时，块根肉质颜色表现为黄色。基于PSY2基因的单核苷酸多态性，前人已开发出一对酶切扩增多态性序列(CAPS)分子标记，并在“新选048”木薯自交系群体中得到了验证，准确率达到了100％，可用于不同薯肉颜色木薯的分子标记辅助选择(尚小红等，申请号为CN201611199010.8的专利技术专利，一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法)。然而，该CAPS分子标记的应用需要一些酶切的步骤，相对于简易的分子标记来讲，费时费力。同时，CAPS分子标记酶切所需要的酶，价格昂贵。此外，在已开发出的CAPS分子标记检测的结果中，黄肉与白肉分子标记的条带仅相隔22bp，条带在琼脂糖凝胶电泳图上太近而不易分辨。以上原因导致该CAPS分子标记存在弊端，也限制了其实用性。因此，迫切需要开发出一种简易易行、快捷且价格低廉的分子标记来降低其繁琐度及成本，提高木薯分子标记辅助育种的效率。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是，针对上述问题，提供一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，简易、高效、条带易读、价格低廉，可大大提高分子标记辅助选择在木薯育种中的实用性及高效性。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，包括以下步骤：S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。S2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定，判定标准为：若仅引物对1能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为白色；若仅引物对2能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为黄色；若引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为浅黄色。优选的，在步骤S1中，所述特异引物核苷酸序列为：引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。优选的，在步骤S1中，反应体系包含基因组DNA(50ng/μL)2μL，2×TaqMasterMix12μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，再加5μLddH2O补齐至20μL。优选的，在步骤S1中，所述PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环，72℃延伸5min，4℃下保存。优选的，在步骤S2中，使用浓度为1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳分离，所述1.5％琼脂糖凝胶是指100mL的TAE缓冲液中含有1.5g琼脂糖粉。优选的，所述电泳分离方法为：取6μLPCR产物与1μL的6×Loadingbuffer混匀后，用含有GelRed核酸染色剂的1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，缓冲液为1×TAE，在110V恒电压下电泳约25min。本专利技术的原理为：PSY2基因的SNP2位点可决定木薯的薯肉是黄色还是白色，根据该SNP区域的碱基序列设计了两对SNAP引物对。SNAP引物设计时，正向引物在SNP突变位点的前两个碱基处人为错配一个碱基以提高等位基因的特异性，反向引物的设计遵循一般引物设计原则。引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，扩增出的PCR产物共388bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，扩增出的PCR产物共388bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：由于采用上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术的鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，可以仅仅通过简单的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可实现在苗期通过提取叶片DNA进行分子标记检测，从而快速的鉴别木薯薯肉颜色，准确的选育出适合于育种目标的木薯材料。2.本专利技术提供的方法简易、高效、条带易读、价格低廉，可大大提高分子标记辅助选择在木薯育种中的实用性及高效性。附图说明图1为本专利技术实施例的电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例一、实验材料：选取种植于广西农业科学院里建基地，主栽木薯品种“新选048”自交所得的29份木薯叶片。具体29份木薯叶片对应的木薯材料的块根肉质颜色见下表：表1样本块根肉质颜色叶片样本块根肉质颜色叶片样本块根肉质颜色叶片样本块根肉质颜色1浅黄色11黄色21浅黄色2白色12白色22浅黄色3白色13浅黄色23浅黄色4白色14浅黄色24浅黄色5白色15...

【技术保护点】
1.一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；/nS2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定，判定标准为：/n若仅引物对1能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为白色；/n若仅引物对2能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为黄色；/n若引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为浅黄色。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
S2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定，判定标准为：
若仅引物对1能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为白色；
若仅引物对2能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为黄色；
若引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为浅黄色。


2.根据权利要求1所述的鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，其特征在于，在步骤S1中，所述特异引物核苷酸序列为：
引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求1所述的鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚小红，严华兵，陈新，肖亮，朴朴森，曹升，谢向誉，王颖，曾文丹，陆柳英，赖大欣，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45