一种基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一个基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7 RNA聚合酶基因T7 RNApoly和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白egfp。本发明专利技术基因电路是一种不依赖诱导剂，可以在任意宿主菌中利用T7表达系统自发强力启动靶基因表达的基因电路；本发明专利技术将基因元件分别构建到不同的表达载体上，在工程菌内部构建了一个迭代基因电路，利用T7表达系统放大费氏弧菌群体感应系统的信号，具有利用T7表达系统自发强力启动靶基因表达的功能并具有更低的渗漏比例和更高的启动强度。

An iterative gene circuit based on the quorum sensing system and T7 expression system of Vibrio fischeri and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于费氏弧菌(Vibriofischeri)的群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用。
技术介绍
发酵工程菌需要合成大量重组蛋白，搭建合成通路，如果在培养起点就开始大量表达重组蛋白会和细胞代谢竞争胞内资源，给菌体带来巨大的负担，代谢网络失衡会导致一些有毒的中间产物的积累，也会对菌体生长造成毒害，使菌株无法保持良好的生长状态，影响最终产物的产量。因此前人探索了多种操纵元件，实现对基因的诱导调控，包括：色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子以及许多杂合操纵子等，其中以受IPTG诱导的乳糖操纵子应用最为广泛。受IPTG诱导调控的T7表达系统是目前最主流的大肠杆菌表达系统，启动效率强大且专一性高，是原核表达的首选，其中德国Novagen公司的PET系列表达载体正是使用的T7表达系统，本文中用到的表达载体也都是PET系列。T7系统中的T7启动子受到T7RNA聚合酶的特异性诱导启动，且不会被许多外源终止子终止，可以高效表达其他系统不能有效表达的基因；T7RNA聚合酶的转率效率是大肠杆菌自身RNA聚合酶的五倍，一旦启动，大肠杆菌自身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的胞内资源都被用于目的蛋白的表达。BL21(DE3)菌株是常用的外源基因表达菌株，它的基因组上整合了λ噬菌体DE3区的基因，含有lacI抑制子和位于lacUV5启动子下游的T7RNA聚合酶基因，正常状态下lacI表达的LacI阻遏蛋白抑制T7RNA聚合酶的表达，T7启动子不启动。当有IPTG存在的情况下，IPTG和LacI竞争性结合，启动下游T7RNA聚合酶的表达，进一步启动表达载体上T7启动子下游基因的表达。诱导型启动子有许多优点，包括能通过调节诱导剂浓度调节基因表达强度、通过控制诱导剂添加时间控制基因表达的启动时间以平衡菌体的生长和产物的合成等。但是诱导型启动子也存在许多问题，包括无法实现靶基因的动态调控、对细胞状态无法及时反馈等。另外，诱导剂昂贵的价格阻碍了其在大规模工业化生产中的应用。解决这一问题的方法之一就是在发酵菌株内引入动态的基因开关来控制途径基因的表达，目前已经有许多这方面的尝试。但是这些策略需要响应于特定的中间产物、细胞状态或者培养基组成，缺乏普适性，无法应对复杂多变的产物需求。而群体感应(Quorumsensing)系统作为细胞密度的监控感应系统同时具有动态调节和通用性的优点。因此，基于群体感应的动态调节系统具有很高的研究价值以及应用前景。来自海洋的发光细菌费氏弧菌(Vibriofischeri)是一种革兰氏阴性菌，通过高丝氨酸内脂介导的QS调节生物发光，并且借助这一特性和许多真核宿主建立起共生关系。费氏弧菌中的LuxI/R群体感应系统由luxicdabe、luxr两个操纵子组成。luxi负责编码信号分子蛋白LuxI，参与信号分子3-oxo-C6-HSL的合成，正常情况下痕量表达。luxr负责编码信号分子受体蛋白LuxR，LuxR和信号分子结合后结构发生改变，可以结合到luxr、luxi基因中间的启动子区，启动下游luxab基因负责编码的荧光素酶亚基基因的表达，同时抑制luxr基因的继续表达，形成负反馈。荧光素酶表达后催化费氏弧菌胞内的分子氧将长链的脂肪醛和还原态的黄素单核苷酸氧化为长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度波长位于450～490nm的蓝绿光。在海水中时，费氏弧菌的浓度较低，其周围的信号分子浓度也较低，因此合成荧光素酶的基因关闭，细菌不发光；当费氏弧菌附着于鱼类或乌贼等海洋生物上时，菌体密度达到一定的程度，荧光素酶基因被强力启动，细菌发出荧光。在费氏弧菌的宿主夏威夷短尾鱿鱼上费氏弧菌可能达到109～1010细胞/cm3的密度，费氏弧菌利用宿主体内丰富的营养物达到相当高的群落密度，发出的荧光又会为宿主吸引到猎物或者摆脱捕食者追捕。两者借此互利共生[8]。现在技术中的有关于费氏弧菌luxI/luxR群体感应系统的报道，一般用来做群体感应抑制剂方面的研究，通过抑制信号分子的合成，促进信号分子的降解和抑制信号分子与受体蛋白的结合等手段抑制微生物的群体感应，防治因群体感应引起的病原菌感染以及食品腐败，但是利用费氏弧菌群体感应系统进行合成生物学设计、实现信号调控的基因电路应用尚未见报道，因为费氏弧菌的群体感应系统自身存在一定的表达渗漏情况，无法实现对靶基因的严谨调控；并且费氏弧菌群体感应系统的启动强度较弱，无法满足下游复杂的电路需求，这限制了群体感应系统的应用。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，该基因电路可以不依赖诱导剂，强力自发动态调节靶基因的表达，并利用该基因电路构建可以在合适的OD600状态下启动靶基因表达的基因工程菌。本专利技术通过将基因元件分别构建到不同的表达载体上，在工程菌内部构建了一个基因电路，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，其特征在于，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7RNA聚合酶基因T7RNApoly和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白基因egfp；其核苷酸序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8所示。其中，所述信号分子蛋白基因luxI和受体蛋白基因luxR组成型转录翻译合成对应的信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白可以合成信号分子，当环境中的信号分子积累到一定浓度后和受体蛋白结合形成信号分子-受体蛋白复合体，信号分子-受体蛋白复合体会结合到PluxI(1)启动子区域并启动下游T7RNA聚合酶基因T7RNApoly的表达，T7RNApoly可以结合到表达载体的T7启动子区域并强力启动下游靶基因的表达，实现信号的放大。同时T7RNA聚合酶可以结合到表达载体上的T7启动子区域，进一步放大信号，启动T7启动子下游信号基因绿色荧光蛋白基因的表达。作为优选，所述基因luxI、luxR、PluxI(1)可以转录翻译合成信号分子蛋白和受体蛋白并调节T7RNApoly的表达。进一步地，所述受群体感应调控表达的T7RNA聚合酶可以结合到T7启动子区域，强力启动信号蛋白绿色荧光蛋白基因egfp的转录和翻译。本专利技术所述表达载体，包含所述的迭代基因电路所需元件，并且使基因电路的表达渗漏最低。进一步地，本专利技术所述的表达载体包含所述的基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路。本专利技术基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，其特征在于，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7 RNA聚合酶基因T7 RNApoly和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白基因egfp。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，其特征在于，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7RNA聚合酶基因T7RNApoly和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白基因egfp。


2.根据权利要求1所述的迭代基因电路，其特征在于，所述信号分子蛋白基因luxI和受体蛋白基因luxR组成型转录翻译合成对应的信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白可以合成信号分子和受体蛋白结合形成信号分子-受体蛋白复合体，信号分子-受体蛋白复合体会结合到PluxI(1)启动子区域并启动下游T7RNA聚合酶基因T7RNApoly的表达，T7RNApoly结合到表达载体的T7启动子区域并强力启动下游靶基因的表达，实现信号的放大；所述PluxI(1)的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。


3.根据权利要求1所述的迭代基因电路，其特征在于，所述基因luxI、luxR、PluxI(1)可以转录翻译合成信号分子蛋白和受体蛋白并调节T7RNApoly的表达。


4.根据权利要求1所述的迭代基因电路，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊俊，周朋，包美娇，董明盛，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32