一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法，该方法首先合成一段序列，该序列包含21个碱基的翻译增强子序列TE21、54个碱基的人白蛋白信号肽序列S，以及不含跨膜区的E2序列，同时在E2序列后面添加了6his序列方便检测和纯化。将该序列连接到pFastbac‑dual的p10启动子下游，构建猪瘟E2重组杆状病毒表达载体，通过转化DH10Bac制备杆粒，杆粒转染昆虫细胞SF9获得能够高效分泌E2蛋白的重组杆状病毒E2‑rBV。本发明专利技术构建的重组杆状病毒E2‑rBV的E2蛋白表达量提高，可同时分泌到培养上清及细胞破碎液上清中，更有利于E2蛋白的糖基化及正确折叠和纯化，该E2蛋白可以用作亚单位疫苗的研发。

A recombinant baculovirus with high expression of CSFV E2 protein and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法。
技术介绍
猪瘟病毒(CSFV)因为其超强的传染性，迅速的传播速度，较广的分布范围，给养殖业带来了很大的经济损失。我国从1956年开始提出消灭猪瘟的计划，如今猪瘟仍在我国不间断流行。目前市场上在售的猪瘟疫苗均为传统疫苗包括猪瘟灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗。全病毒疫苗虽然免疫效果好，但是由于其存在灭活不彻底，毒力反强，基因突变造成新的毒株出现等风险，另外全病毒疫苗也无法区别免疫与野毒感染，为猪瘟净化带来困难。随着猪瘟净化的日趋紧迫，猪瘟病毒亚单位疫苗完全规避了这些缺点，成为未来市场的一个焦点。CSFV为有囊膜单股正链RNA病毒，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，其中结构蛋白E2分子量为55kDa，是保守性最低、最易变异的分子。E2也是最主要的免疫保护性蛋白。在病毒感染进入细胞的过程中，一定浓度的E2蛋白可抑制病毒进入细胞的介导作用，阻断CSFV对体外培养细胞的感染。以病毒为载体或其它表达纯化的CSFVE2蛋白均能保护免疫猪只抵抗CSFV的感染。最近研究显示糖蛋白E2是毒力的决定因子。目前猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗，天康生物股份有限公司，已经获得新兽药证书。CN106139139A公布了一项猪瘟E2基因工程亚单位疫苗制备，利用的杆状病毒表达载体是pFastBac1，进行E2蛋白的表达和纯化，E2序列前面添加了GP67信号肽序列。CN106110319A公布了猪瘟病毒E2基因重组杆状病毒灭活疫苗制备方法。前面添加了MELs信号肽获得了可溶性E2蛋白，表达载体是pFastBac-dual。CN109182380A公布了一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗的制备方法及应用，利用含有信号肽的猪瘟E2蛋白，表达载体是pFastBacTM-HTB。在猪瘟E2基因工程亚单位疫苗研发过程中，E2蛋白的表达量及可溶性一直是制约其产业化的因素之一。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术专利设计了一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒的构建方法。首先，本专利技术人工合成了一段用于构建高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒的基因序列，该序列包含一段富含AT碱基的翻译增强子序列TE21，大小为21个碱基；一段人白蛋白信号肽序列S，编码17个氨基酸MKWVTFISLLFLFSSAY，大小为51个碱基；以及去除跨膜区的猪瘟E2序列，大小为1011个碱基；和6个组氨酸his序列，大小为18个碱基，序列的两端分别含有XhoI和KpnI酶切位点。该基因序列如SEQIDNO.1所示，命名为：TE21-S-E2-6His。进一步的，所述增强子序列TE21如SEQIDNO.2所示，所述信号肽序列S如SEQIDNO.4所示。同时本专利技术设计了一种用于上述基因序列表达的载体，所述表达载体通过XhoI和KpnI酶切序列TE21-S-E2-6His以及载体pFastbac-dual，回收连接片段和载体片段，转化DH5α,并经克隆PCR验证测序验证构建载体，该载体命名为TE21-S-E2-6His-pFastbac-dual。本专利技术专利还设计了一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒，所述重组杆状病毒经载有上述基因序列的质粒转染，命名为TE21-S-E2-rBV(rBV-DC-1株)，于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.18508。上述高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤，(1)人工合成权利要求1所述的TE21-S-E2-6His序列；(2)XhoI和KpnI酶切TE21-S-E2-6his序列和pFastbac-dual载体序列，回收片段syn-s-E2-6his和pFastbac-dual，连接转化克隆测序验证，构建TE21-S-E2-6his-pFastbac-dual表达载体；(3)将TE21-S-E2-6his-pFastbac-dual表达载体转化DH10Bac，通过蓝白斑筛选以及PCR鉴定获得重组杆粒TE21-S-E2-6his-rBacmid；(4)将重组杆粒TE21-S-E2-6his-rBacmid转染SF9细胞，收获P1代杆毒，传代培养至P3代，对P3代杆毒进行E2蛋白的表达验证，获得能够高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒，该重组杆状病毒命名为TE21-S-E2-rBV株。相对与现有技术，本专利技术专利设计的高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒的进步之处在于，首先提供了一段含有翻译增强子序列TE21、人白蛋白信号肽序列S及不含跨膜区的猪瘟E2蛋白基因序列，该序列插入插入到杆状病毒表达载体中，为猪瘟E2蛋白在杆状病毒中的高效表达提供了有力的支撑；还有通过本专利技术设计的构建方法得到的重组杆状病毒的E2蛋白的表达量明显提高，且更有利于蛋白的分泌，可以在培养基上清液及细胞破碎液的上清液中检测到E2蛋白，更有利于E2蛋白的糖基化及正确折叠和纯化，E2蛋白的糖基化及正确折叠能够提高其在猪只体内的的免疫原性，因此该E2蛋白可很好的应用于猪瘟病毒亚单位疫苗的研发中。附图说明图1是实施例4的WB检测结果图2是实施例5中Elisa检测E2亚单位疫苗免疫小鼠后抗体水平具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。本专利技术实施列中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。本专利技术试剂、菌株和质粒来源名单如下：SF9细胞购买于美国Invitrogen公司pFastbac-dual购买于美国Invitrogen公司细胞培养基购自于美国Gibco公司转染试剂ExpiFectamineSF购自于美国Gibco公司序列和引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司PCR聚合酶和限制性内切酶购买于英国NEB公司DH10Bac感受态购买于北京索莱宝公司ISA201佐剂购买于法国赛比克公司实施例1TE21-S-E2-6His序列合成参考国内经典毒株C株的E2基因序列，合成TE21-S-E2-6His序列，该序列中包含一段富含AT碱基的翻译增强子序列TE21，大小为21个碱基，其碱基序列如SEQIDNO.2所示；一段人白蛋白信号肽序列S，大小为51个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该信号肽序列S编码17个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；以及猪瘟E2蛋白的截断E2序列，大小为1011个碱基；和6组氨酸his序列，大小为18个碱基，序列的两端分别含有XhoI和KpnI酶切位点。合成后的TE21-S-E2-6His序列如SEQIDNO.1所示。S-E2-6His序列编码的蛋白质序列如SEQIDNO.3所示。实施例2杆状病毒表达载体构建...

【技术保护点】
1.一段人工合成的基因序列，其特征在于，所述基因序列含有一段富含AT碱基的翻译增强子序列TE21，一段人白蛋白信号肽序列S，不含跨膜区的E2序列以及6个组氨酸的6his序列，该序列如SEQ ID NO.1所示，该序列命名为TE21-S-E2-6His。/n

【技术特征摘要】
1.一段人工合成的基因序列，其特征在于，所述基因序列含有一段富含AT碱基的翻译增强子序列TE21，一段人白蛋白信号肽序列S，不含跨膜区的E2序列以及6个组氨酸的6his序列，该序列如SEQIDNO.1所示，该序列命名为TE21-S-E2-6His。


2.根据权利要求1所述的一段人工基因合成的基因序列，其特征在于，所述增强子序列TE21如SEQIDNO.2所示，所述信号肽序列S如SEQIDNO.4所示。


3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体通过XhoI和KpnI酶切序列TE21-S-E2-6His以及载体pFastbac-dual，回收连接片段，并经筛选验证克隆构建而成，该表达载体命名为TE21-S-E2-6His-pFastbac-dual。


4.一种高效表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒经载有权利要求1所述的基因序列的质粒转染，命名为TE21-S-E2-rBV株，于2019年9月19日保藏于中...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜凤，郭兆隆，杨施瑜，郑杰，马宁宁，
申请(专利权)人：北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11