一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种监测pre‑mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A‑B‑C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成，所述的片段C为Rluc。所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。通过对本发明专利技术的报告基因分子影像探两种荧光素酶产生的信号比值Fluc/Rluc进行分析，实时、无创地分析在体pre‑mRNA的剪接效率，为调控pre‑mRNA剪接的药物研究提供了有效的筛选工具。

A double reporter gene probe for monitoring the splicing efficiency of pre mRNA and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法
本专利技术属于分子生物学和基因工程
，具体涉及一种监测pre-mRNA的双报告基因影像探针及制备方法。
技术介绍
Pre-mRNA剪接过程的化学本质包含两步转酯反应。该化学反应在细胞中难以自行发生，需要剪接体的参与完成。剪接体是指进行Pre-mRNA剪接时形成的多组分复合物，主要是由小分子的核RNA和蛋白质组成。它是在剪接过程的各个阶段随着SNRNA的加入而形成的。也就是说在完整的pre-mRNA上形成的一个剪接中间体。剪接体本身需要一些小核RNA参与。这些小核RNA不会翻译出任何蛋白，但对于调控遗传活动起到重要作用。因为许多人类疾病都可以归咎于基因的错误剪接或针对剪接体的调控错误。据知人类35％的遗传紊乱是由于基因突变导致单个基因的可变剪接引起的。还有一些疾病的起因是剪接体蛋白的突变影响了许多转录本的剪接。还有一些癌症也与剪接因子的错误调控有关。现在研究者们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段，初步建立起剪接体的组装、激活与解聚的发生过程，以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。但由于剪接体高度的动态性和复杂性，一直以来缺乏可靠的系统来检测剪接效率。因此本专利技术开发了一种双荧光素酶报告基因影像探针，实时监测pre-mRNA剪接效率，为研究pre-mRNA的剪接提供稳健、快速和方便的检测工具。本专利技术运用分子影像手段，开发了基于双荧光素酶报告基因的显像系统定量分析pre-mRNA的剪接效率。为实时、快速、定量的研究剪接效率提供了检测工具。通过载体报告基因系统在活体中的稳定表达，无创、重复的提供活体实时、动态、可视化的分子剪接信息，同时进行定量研究，将其中的两种荧光信号进行分析，可实时评估剪接体在体内的剪接过程及剪接效能，检测体内基因表达情况。对剪接相关的基因进行成像，对于优化基因治疗方案和评估疗效起着关键作用。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术旨在提供一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，根据两种荧光素酶所产生的荧光强度，监测剪接过程的发生发展及剪接效率。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon1、Intron、exon2组成，所述的片段C为Rluc。所述的片段A的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的片段C的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术所述的探针的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的另一方面，提供了一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，包括以下步骤：1)用KpnI和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；2)PCR扩增A、B、C片段；3)基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；4)重组载体经转化、提取质粒、酶切鉴定，获得Dual-Luc报告基因探针。所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon1、Intron、exon2组成，所述的片段C为Rluc。步骤(2)中扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的有益效果为：本专利技术构建了一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，由于其能够很好地在生物体内表达，具有以下优点：(1)为模拟活体剪接加工过程的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具。(2)克服了传统方法体外含量分析可能与体内实际作用出现偏差的不足。(3)由于报告基因系统靶向性强、安全性好、高通量、价格相对低廉、操作方便等优点，为作用于剪接体的药物研究提供了有效的筛选工具，在新药研制、观测生物体内生理病理过程有着非常重要的价值。附图说明图1是本专利技术Dual-Luc报告基因探针的原理图；图2是本专利技术分子探针的结构图；图3是不同浓度PladienolideB作用下报告基因活性检测；图4是PladienolideB作用后不同时间点报告基因活性检测；图5是Dual-Luc报告基因系统在体活性检测。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1Dual-Luc报告基因探针的构建1.1实验材料1.1.1主要仪器PCR扩增仪：北京东胜创新生物科技有限公司；Centrifuge5415D台式离心机：Eppendorf；高速冷冻离心机：Beckmancoulter；数显恒温水浴锅：江苏国华电器有限公司；THZ-92A台式恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；紫外分析仪：北京君意东方电泳设备公司；电泳仪：北京君意东方电泳设备公司；Genosens800凝胶成像系统：上海勤翔科技有限公司；超净工作台：上海一恒科技有限公司；恒温振荡培养箱：江苏太仓实验设备厂。1.1.2酶和试剂1.1.3实验所用溶液LB培养基：10gNacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物溶于1L双蒸水，高压灭菌。琼脂糖凝胶制备：5.6g琼脂糖，置于500ml锥形瓶，加入1×TAE480ml，加热完全溶解后再冷却50-60℃，倒入事先准备好的制胶板中。TAE琼脂糖凝胶电泳液：50×TAE贮存液配置：242gTris，57.1ml乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O溶于1L水，并调PH至8.0。1×TAE：电泳时将50×TAE配置成1×工作液使用。2×上样缓冲液：0.5mol/L(PH6.8)Tris-Hcl2ml，甘油2ml，20％SDS(W/V)2ml，0.1％溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇1.0ml，双蒸水2.5ml，室温存放备用。1.1.4实验所用菌株和载体菌株：XL10-gold。载体:pCDNA3.1(+)。1.2实验过程1.2.1实验方案设计及引物合成根据全基因序列，合成引物进行PCR扩增。本实验中所使用的所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司引物合成部合成。1.2.3克隆30ul，150ng/ul待切的载体，NheI/PstI各1ul酶，5ulBuffer，加水补齐至50ul体系，放入恒温培养培养箱2-3h后，回收所需的载体骨架备用。将上述PCR扩增得到的基因全长PCR序列和载体各4ul，加同源重组酶重组1.4ul，同源重组酶Buf本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，其特征在于，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成，所述的片段C为Rluc。/n

【技术特征摘要】
1.一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，其特征在于，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon1、Intron、exon2组成，所述的片段C为Rluc。


2.根据权利要求1所述的一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，其特征在于，所述的片段A的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的片段C的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求1所述的一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：王福，郭镔，郑海锋，解锦荣，陈思，王希楠，施潇蕊，毛文杰，
申请(专利权)人：西安电子科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61