一种牙髓干细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种牙髓干细胞的制备方法。该制备方法包括以下步骤：1)消毒；2)取牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000UI\ml链霉素+1000UI\ml青霉素+生理盐水)冲洗，剪成1mm

A preparation method of dental pulp stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种牙髓干细胞的制备方法
本专利技术属于细胞生物学干细胞培养
，具体涉及一种牙髓干细胞的制备方法。
技术介绍
干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿与脂肪。2000年首次发现了牙髓干细胞，Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓干细胞。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多项分化能力的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。牙髓干细胞(dentalpulpstemcell，DPSC)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。Gronthos等对牙髓干细胞的克隆形成率进行了研究，与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)比较后发现：牙齿来源的DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC，这就表明DPSC具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。Miura等发现：从1颗脱落前牙取材的每12-20个细胞就可以形成黏附克隆集落，这是间质干细胞增殖的典型表现。牙髓干细胞属于多能成体干细胞，具有分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的潜能。研究表明，牙髓干细胞能够用于牙本质、牙髓、牙体组织的修复和再生，还可用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复，牙髓干细胞在其他疾病方面的应用研究也很多。其具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展，具有广阔的应用前景。目前对于牙髓组织的提取和培养过程，传统方法为组织块直接培养法和胶原酶消化培养法两种，但存在培养周期过长、细胞量较少、易导致分化以及消化不完全或消化过度等缺点。由于人体口腔中细菌和真菌的种类繁多、数量巨大，牙髓干细胞在制备过程中极易污染，通常会通过加大抗生素的用量或提高抗生素等级来降低污染几率，从而导致抗生素滥用。因此，在牙髓干细胞制备过程中防止抗生素滥用、提高分离牙髓干细胞的效率、缩短生长周期，是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术目的是提供一种牙髓干细胞的制备方法，该方法提高了牙髓干细胞的获得率，缩短细胞培养周期，保障细胞质量。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种牙髓干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)消毒；2)取牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000UI\ml链霉素+1000UI\ml青霉素+生理盐水)冲洗，剪成1mm3小块；3)组织消化：消化液使用0.1-0.5％胶原酶Ⅰ+0.1-0.5％DispaseII+生理盐水，密封消化管口，恒温37±5℃，145-167rpm振荡消化15-30min；4)离心，弃上清，用生理盐水洗涤后，离心弃上清；5)培养：使用间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)37±5℃、5％二氧化碳培养。进一步地，步骤1)中，所述消毒是无菌操作，用75％的酒精将牙齿浸泡30s～2min，牙齿要完全浸没。更进一步地，步骤1)中，所述消毒还包括将酒精浸泡过的牙齿使用含有抗生素的生理盐水清洗3-5遍。更进一步地，所述抗生素为1000UI\ml链霉素+1000UI\ml青霉素。进一步地，步骤1)中，所述消毒还包括将洁净车间使用紫外线灯照射30min的步骤；还包括将牙齿储存瓶、灭菌手术器械盒、50ml离心管、75％医用酒精、生理盐水、培养皿用75％医用酒精消毒后放入生物安全柜内。进一步地，步骤2)中，所述取牙髓为将牙齿用无菌无尘布包裹，用台虎钳夹裂，用眼科镊取出牙髓。进一步地，步骤3)中，所述消化液成分终浓度为0.1％胶原酶Ⅰ+0.1％DispaseII+生理盐水。进一步地，步骤4)中，所述离心为1000～1500r/min离心5～8min。进一步地，步骤5)中，所述培养为使用间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)重悬，重悬后的组织块均匀接种于培养皿，将培养皿放入37±5℃、5％二氧化碳培养箱培养。进一步地，步骤5)中，所述血小板裂解物成分如下所示：进一步地，步骤5)中，还包括补液的步骤，第二天补液(5％血小板裂解物+95％基础培养基)，以后每三天半换液一次，待细胞融合度达30％-60％进行传代。与现有技术相比，本专利技术能够有效获得牙髓干细胞的单细胞悬液，或者软化牙髓组织，更有利于牙髓干细胞爬出，很好的提高了牙髓干细胞的获得率，缩短细胞培养周期，保障细胞质量。附图说明图1为实施例1中原代牙髓干细胞培养图；图中，A为原代牙髓干细胞培养第3天；B为原代牙髓干细胞培养第8天；C为原代牙髓干细胞培养第10天；D为原代牙髓干细胞培养第15天；图2为效果试验例中原代培养第三天的牙髓干细胞；图中，a为对照方法制备所得牙髓干细胞；b为本方法制备所得牙髓干细胞。具体实施方式本专利技术所使用的间充质干细胞培养基包含5％血小板裂解物+95％基础培养基。其中，血小板裂解物成分如下表1。表1血小板裂解物成分项目浓度球蛋白Globulin1.8g/dL白蛋白Albumin3.3g/dL胆固醇Cholesterol128mg/dL胆红素Bilirubin0.2mg/dL葡萄糖Glucose208mg/dL甘油三酯Triglyceride80mg/dL肌酸磷酸激酶CPK159U/L肌酸酐Creatinine0.92mg/dLγ-GT26U/L天门冬氨酸转移酶AST43U/L碳酸氢盐Bicarbonate14.2meq/L钠Sodium140meq/L磷Phosphorus3.9mg/dL钙Calcium61.5mg/dL镁Magnesium2.1mg/dL钾Potassium4.4meq/L氯化物Chloride109meq/L铁Iron64ug/dL基础培养基选用深圳市达科为生物工程有限公司生产的MSC专用基础培养基(产品6115021)是专用于培养人间充质干细胞(MesenchymalStemCell)的基础培养基。本产品化学成分限定，不含异种动物成分，不含血清，需要添加血清或者血清替代物混合成完全培养基后使用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙髓干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)消毒；/n2)取牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000UI\ml链霉素+1000UI\ml青霉素+生理盐水)冲洗，剪成1mm

【技术特征摘要】
1.一种牙髓干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)消毒；
2)取牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000UI\ml链霉素+1000UI\ml青霉素+生理盐水)冲洗，剪成1mm3小块；
3)组织消化：消化液使用0.1-0.5％胶原酶Ⅰ+0.1-0.5％DispaseII+生理盐水，密封消化管口，恒温37±5℃，145-167rpm振荡消化15-30min；
4)离心，弃上清，用生理盐水洗涤后，离心弃上清；
5)培养：使用间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)37±5℃、5％二氧化碳培养。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述消毒是无菌操作，用75％的酒精将牙齿浸泡30s～2min，牙齿要完全浸没。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述消毒还包括将酒精浸泡过的牙齿使用含有抗生素的生理盐水清洗3-5遍。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述消毒还包括将洁净车间使用紫外线灯照射30min的步骤；还包括将牙齿储存瓶、灭菌手术器械盒、50ml离心管、75％医用酒精、生理盐水、培养皿用75...

【专利技术属性】
技术研发人员：车小红，陈庆林，
申请(专利权)人：北京泓信干细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11