一种黑果枸杞多糖的提取方法及其应用技术

本发明专利技术以黑果枸杞为原料提取多糖，采用蒽酮‑乙酸乙酯‑浓硫酸溶液测定多糖的含量。对黑果枸杞的果实进行粉碎、浸泡、加热、过滤、抽滤等处理，得到含有黑果枸杞多糖的溶液。提取的黑果枸杞多糖经水提醇沉、抽滤，滤饼置于烘箱中烘干，分别取多糖粉末，加入的DMSO后溶解，磁力搅拌器下搅拌12小时，加入蒸馏水，抽滤。沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤、干燥后得到黑果枸杞多糖精制品；将得到的黑果枸杞多糖精制品经过大孔树脂脱色、Sevage法脱蛋白后，即得到所述的黑果枸杞多糖。用DMSO法精制使得多糖的得率大大提高，该黑果枸杞多糖应用到K562细胞上，可以通过改变线粒体通路中相关凋亡蛋白的表达量促进细胞凋亡，具有抗白血病肿瘤的作用。

An extraction method of Lycium barbarum polysaccharide and its application

【技术实现步骤摘要】
一种黑果枸杞多糖的提取方法及其应用
本专利技术属于多糖提取
，具体涉及一种黑果枸杞多糖的提取方法及其应用。
技术介绍
黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是茄科、枸杞属多年生灌木。分为野生和人工栽培品，其中野生品花青素含量高于人工栽培品。我国的主要产区是青海、新疆和甘肃地区，以青海柴达木盆地为最好，该地区的光照时间长，昼夜温差大，荒漠盐土上可形成大面积的黑枸杞灌丛。本实验取自青海柴达木盆地野生黑果枸杞。黑果枸杞最突出的特点花青素含量高，研究较多，而多糖是其提高免疫力的主要物质基础，相关报道较少。多糖(polysaccharide)是一类具有天然生物活性的聚合物，由10个及以上单糖连接而成具有多羟基的醛或酮类的化合物，易溶于水。多糖在生物体内不仅是提供能量和组成结构的物质，更具有清除自由基，提高免疫力和抗肿瘤和抑制肿瘤转移等功能，其作用机制是多靶点，多环节的，显示出了很好的临床前景。现有黑枸杞多糖的提取工艺多为传统的热水浸提法或有机溶剂(乙醚、乙醇、石油醚等)脱脂后热水浸提法，这些常规方法中溶剂用量大、耗时长且提取率低，为提高黑枸杞子的经济效益，提高黑枸杞子中有效成份的提取率，寻找快速而有效的黑枸杞多糖提取方法是枸杞产业化发展的一个重要研究课题。白血病是血液系统里异常的原始造血干细胞失去了分化成熟的能力而停留在细胞发育的不同阶段的克隆性恶性肿瘤。临床症状为发热、严重贫血、淋巴结肿大及出血，严重时会导致急性死亡，是一类危害人类健康的重要的恶性肿瘤，被人们所恐惧。儿童白血病是所有儿童恶性肿瘤中发病率最高的，儿童的慢性白血病，尤其是慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)，是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性的增生疾病，在骨髓和造血组织中粒细胞会大量增生积聚并浸润其他组织和器官，其发病率为1-2/10万。多糖因其毒副作用小，资源丰富，是抗肿瘤佐剂的发展方向，使肿瘤患者看到希望。目前多糖的提取方法主要有水提取法，酸碱浸提，微波法，酶法。酸碱提取法后期需要中和，且提取条件比较剧烈，对糖链破坏性较大，目前已少用；微波法的提取时间不宜长，功率不宜过高，否则会导致水分蒸发过度，多糖溶出受阻，同时，该法降低了了某些反应的活化能，使得多糖分子间，多糖与其他分子间形成新的作用力，阻止多糖分子的溶出；酶法提取反应温和，弊端是纤维素酶和果胶酶的运用，难以控制，往往容易得到大量的寡糖，具有抗肿瘤生物活性的寡糖通常含量很少。以上提取方法虽各有利弊，但总体提取效率较低，多糖的获得在精制环节损失较大，并且黑果枸杞多糖在抗肿瘤上的应用较少的，因此本专利技术提供一种黑果多糖的提取方法及在抗肿瘤中的应用。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种黑果枸杞多糖的提取方法及其应用。一方面，本专利技术提供了一种黑果枸杞多糖的提取方法，包括以下步骤：(1)将黑果枸杞洗净后，在40℃下烘干，经过脱水、粉碎、过300目筛、干燥后得到黑果枸杞粉末；(2)将黑果枸杞粉末加入蒸馏水中，搅拌均匀后，在70-90℃下提取2-3h后，经过过滤后即得到所述的黑果枸杞多糖的提取溶液；所述黑果枸杞粉末和蒸馏水的料液比为1:20-1:30g/mL；(3)将步骤(2)黑果枸杞多糖的提取溶液加入乙醇，酒精计检测酒精度为90％后，进行抽滤，将得到的滤饼置于烘箱中在60℃下烘干30min后，得到多糖粉末；(4)将步骤(3)得到的5g多糖粉末加入10-50mL的DMSO后溶解后，磁力搅拌12h后，加入50mL蒸馏水，继续搅拌20min后放置2h，然后进行抽滤，将得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，在70℃下干燥30min，得到黑果枸杞多糖精制品；(5)将步骤(4)得到的黑果枸杞多糖精制品经过大孔树脂脱色、Sevage法脱蛋白后，即得到所述的黑果枸杞多糖(LBP)。优选地，所述步骤(2)为将黑果枸杞粉末加入蒸馏水中，搅拌均匀后，在70℃下提取3h后，经过过滤后即得到所述的黑果枸杞多糖的提取溶液；所述黑果枸杞粉末和蒸馏水的料液比为1:25g/mL。优选地，所述(4)为将步骤(3)得到的5g多糖粉末加入50mL的DMSO后溶解后，磁力搅拌12h后，加入50mL蒸馏水，继续搅拌20min后放置2h，然后进行抽滤，将得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，在70℃下干燥30min，得到黑果枸杞多糖精制品。另一方面，本专利技术提供了上述制备得到的黑果枸杞多糖在抗白血病肿瘤上的应用，采用CCK8实验发现黑果枸杞多糖(LBP)有抑制人慢性粒细胞白血病细胞株K562体外增殖的现象，并采用WesternBlotting法检测线粒体通路相关凋亡蛋白的表达情况，发现LBP可以使通路中抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，促凋亡蛋白Bax表达上升，凋亡抑制因子xIAP表达下降，并能使线粒体膜破裂，释放细胞色素C(Cyt-C)，使得细胞质中的C(Cyt-C)含量增加。以上结果表明LBP可以通过线粒体通路来诱导肿瘤细胞凋亡，具有抗白血病肿瘤的作用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的黑果枸杞多糖的提取方法采用蒸馏水为提取介质，方法简单、高效。以黑果枸杞为原料提取多糖，采用蒽酮-乙酸乙酯-浓硫酸溶液测定多糖的含量。对黑果枸杞粉末进行浸泡、加热、过滤、抽滤等处理，得到含有黑果枸杞多糖的溶液。通过改变料液比、提取温度、提取时间等影响因子，正交试验提取结果表明，黑果枸杞多糖的最优提取工艺条件是料液比为1：25g/mL，提取温度为70℃，提取时间为3h，提取的多糖含量最高。用DMSO法精制使得多糖的得率大大提高，当DMSO加入体积为50mL时，得率高达66.34％，并且使得后续的脱蛋白的时间大大缩短。采用CCK8实验发现黑果枸杞多糖(LBP)有抑制人慢性粒细胞白血病细胞株K562体外增殖的现象，该黑果枸杞多糖(LBP)应用到K562细胞上，可以通过改变线粒体通路中相关凋亡蛋白的表达量促进细胞凋亡，具有抗白血病肿瘤的作用。附图说明图1为不同浓度葡萄糖溶液最大吸收波长图；图2为不同浓度葡萄糖溶液标准曲线图；图3为实施例1制备得到的黑果枸杞多糖对K562细胞生长的抑制率图；图4为实施例1制备得到的黑果枸杞多糖对线粒体通路中Bcl-2和Bax蛋白表达量灰度图；图5为实施例1制备得到的黑果枸杞多糖对线粒体通路中xIAP和cyt-C蛋白表达量灰度图。具体实施方式实施例1一种黑果枸杞多糖的提取方法包括以下步骤：(1)将黑果枸杞洗净后，在40℃下烘干，经过脱水、粉碎、过300目筛、干燥后得到黑果枸杞粉末；(2)将黑果枸杞粉末加入蒸馏水中，搅拌均匀后，在70℃下提取3h后，经过过滤后即得到所述的黑果枸杞多糖的提取溶液；所述黑果枸杞粉末和蒸馏水的料液比为1：25g/mL；(3)将步骤(2)黑果枸杞多糖的提取溶液加入乙醇，酒精计检测酒精度为90％后，进行抽滤，将得到的滤饼置于烘箱中在60℃下烘本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑果枸杞多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)将黑果枸杞洗净后，在40℃下烘干，经过脱水、粉碎、过300目筛、干燥后得到黑果枸杞粉末；/n(2)将黑果枸杞粉末加入蒸馏水中，搅拌均匀后，在70-90℃下提取2-3h后，经过过滤后即得到所述的黑果枸杞多糖的提取溶液；所述黑果枸杞粉末和蒸馏水的料液比为1:20-1:30g/mL；/n(3)将步骤(2)黑果枸杞多糖的提取溶液加入乙醇，酒精计检测酒精度为90％后，进行抽滤，将得到的滤饼置于烘箱中在60℃下烘干30min后，得到多糖粉末；/n(4)将步骤(3)得到的5g多糖粉末加入10-50mL的DMSO后溶解后，磁力搅拌12h后，加入50mL蒸馏水，继续搅拌20min后放置2h，然后进行抽滤，将得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，在70℃下干燥30min，得到黑果枸杞多糖精制品；/n(5)将步骤(4)得到的黑果枸杞多糖精制品经过大孔树脂脱色、Sevage法脱蛋白后，即得到所述的黑果枸杞多糖。/n

【技术特征摘要】
1.一种黑果枸杞多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将黑果枸杞洗净后，在40℃下烘干，经过脱水、粉碎、过300目筛、干燥后得到黑果枸杞粉末；
(2)将黑果枸杞粉末加入蒸馏水中，搅拌均匀后，在70-90℃下提取2-3h后，经过过滤后即得到所述的黑果枸杞多糖的提取溶液；所述黑果枸杞粉末和蒸馏水的料液比为1:20-1:30g/mL；
(3)将步骤(2)黑果枸杞多糖的提取溶液加入乙醇，酒精计检测酒精度为90％后，进行抽滤，将得到的滤饼置于烘箱中在60℃下烘干30min后，得到多糖粉末；
(4)将步骤(3)得到的5g多糖粉末加入10-50mL的DMSO后溶解后，磁力搅拌12h后，加入50mL蒸馏水，继续搅拌20min后放置2h，然后进行抽滤，将得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，在70℃下干燥30min，得到黑果枸杞多糖精制品；
(5)将步骤(4)得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦静波，张现峰，李燕子，姚欣宇，
申请(专利权)人：蚌埠学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34