一种冷冻保存动物精子的方法技术

本发明专利技术涉及一种冷冻保存动物精子的方法，包括以下步骤：（1）将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20‑35℃；（2）用动物精子稀释液按精子数300‑1000万/mL稀释，灌装并封口，得到细管精液；（3）以0.1‑0.5℃/min的速度降温至0‑4℃；（4）静置1h‑2h；（5）将细管精液放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm‑2.0cm，温度为零下100℃‑120℃，熏蒸5min‑15min，直接投到液氮里，得到细管冻精，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。本发明专利技术解决了传统方法在保存动物精子时，观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。

A method of cryopreservation of animal sperm

【技术实现步骤摘要】
一种冷冻保存动物精子的方法本专利技术是分案申请，原中国专利申请号为：201610494390.1，申请日为：2016年6月29日，原申请的专利名称为：动物精子稀释液及其制备方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存精子的方法。
本专利技术属于动物
，尤其涉及一种冷冻保存动物精子的方法。
技术介绍
动物精子在保存时，通常以冷冻或冷藏的方法进行。在保存时，一般会加入动物源稀释液。现有技术中，由于保存过程中操作不合理或动物源稀释液的配方不合适，会影响动物精子的活力和保存时间。例如，加入卵黄稀释液会引入其他动物源的病原微生物，给人工授精母畜群带来疾病，特别是在配制稀释液时加入大量的抗生素，不规范使用抗生素以致超级细菌产生。卵黄稀释液现用现配不易保存不用的蛋清或蛋壳在垃圾桶内不及时处理实验室容易有臭鸡蛋的味道，污染环境。卵黄稀释液在显微镜下观察精子活力，由于存在卵黄颗粒使视野不清晰，不易于观察。也有研究者利用无动物源的物质制备动物精子稀释液，但是该稀释液利用的物质如咖啡因属于禁销药品，不适合大批量推广应用，而且有精子活力不持久、存活时间短的问题。
技术实现思路
鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供一种冷冻保存动物精子的方法。本专利技术的目的是为了解决传统方法制备的动物精子稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题，而提供了动物精子稀释液及其配制方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存精子的方法。本专利技术的动物精子稀释液由丙三醇、葡萄糖、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、脱脂小麦蛋白粉（蛋白质、小麦蛋白肽）、脱脂豌豆蛋白粉(蛋白质、K因子、胡萝卜素、维生素Bt、维生素E、维生素C)、脱脂花生蛋白粉(蛋白质、钙、磷、铁、硫胺素，棕榈酸、维生素A、B、C、E、K)、脱脂大豆蛋白粉（蛋白质、卵磷脂、植物免疫因子、植物微量元素）和灭菌蒸馏水组成。本专利技术提供一种动物精子稀释液，由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。本专利技术的有益效果：本专利技术通过合理的设置各组分以及各组分的配比，具有精子活力持久、存活时间长等优点。本专利技术解决了传统方法的动物精子稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。上述的动物精子稀释液可以按以下步骤制备：（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h-48h；（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物精子稀释液。采用上述方案的有益效果：通过上述方法制备的动物精子稀释液，具有精子活力持久、存活时间长等优点。本专利技术解决了传统方法的动物精子稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。进一步，步骤（2）超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h。采用上述方案的有益效果：采用上述参数可以进一步提高动物精子稀释液的品质。进一步，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.5g-1g或0.1g-0.5g。上述的动物精子稀释液的制备方法按以下步骤进行：（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、脱脂豌豆蛋白粉（0.5g-1g或0.1g-0.5g）、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物精子稀释液。采用上述方案的有益效果：可以进一步提高动物精子稀释液的品质。优选的，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.1g。优选的，所述三羟甲基氨基甲烷的质量为20g，灭菌蒸馏水的体积为180mL。优选的，柠檬酸质量为10g或12g。优选的，葡萄糖质量为10g或15g。优选的，脱脂大豆蛋白粉的质量为0.5g，脱脂花生蛋白粉的质量0.5g，脱脂小麦蛋白粉的质量0.2g。优选的，果糖质量为10g，丙三醇体积为50mL。采用上述方案的有益效果：采用上述参数可以进一步提高动物精子稀释液的品质，提高动物精子稀释液的使用效果。本专利技术提供一种利用动物精子稀释液冷冻保存精子的方法，按以下步骤进行：（1）将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20-35℃；（2）将步骤（1）中的动物精液用分光光度计测量密度，用动物精子稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到细管中并封口，得到细管精液；（3）将步骤（2）中的细管精液放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；（4）将步骤（3）中的细管精液平衡1h-2h；（5）将步骤（4）的细管精液放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm-2.0cm，温度约为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。本专利技术的有益效果：本专利技术采用的上述保存方法具有精子活力持久、存活时间长等优点。进一步，所述动物精子稀释液，由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。本专利技术解决了传统方法在保存动物精子时，观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生等问题。上述动物精子稀释液按以下步骤制备：（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冷冻保存动物精子的方法，其特征在于，按以下步骤进行：/n（1）将采集到的动物精液在20-35℃保存；/n（2）将步骤（1）中的动物精液测量密度，用动物精子稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，灌装到冻精细管中并封口，得到细管精液；/n（3）将步骤（2）中的细管精液以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；/n（4）将步骤（3）中的细管精液静置1h-2h；/n（5）将步骤（4）的细管精液放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm-2.0cm，温度为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，得到细管冻精，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。/n

【技术特征摘要】
1.一种冷冻保存动物精子的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
（1）将采集到的动物精液在20-35℃保存；
（2）将步骤（1）中的动物精液测量密度，用动物精子稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，灌装到冻精细管中并封口，得到细管精液；
（3）将步骤（2）中的细管精液以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；
（4）将步骤（3）中的细管精液静置1h-2h；
（5）将步骤（4）的细管精液放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm-2.0cm，温度为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，得到细管冻精，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。


2.根据权利要求1所述一种冷冻保存动物精子的方法，其特征在于，所述动物精子稀释液，由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。


3.根据权利要求1所述一种冷冻保存动物精子的方法，其特征在于，动物精子稀释液按以下步骤制备：
（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；
（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放...

【专利技术属性】
技术研发人员：许红喜，卫喜明，宋伟红，甘文平，孙晓玉，张洪涛，韩志强，
申请(专利权)人：许红喜，
类型：发明
国别省市：黑龙;23