生产胶原酶的改进方法技术

本发明专利技术涉及胶原酶生产和胶原酶产物的领域，特别涉及提高胶原酶I和胶原酶II组合物的再现性、纯度和稳定性，其中所述组合物经反相高压液相色谱(RP‑HPLC)测量的纯度以面积计为至少95％，并且本质上不含中性蛋白酶。

Improved method of producing collagenase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产胶原酶的改进方法相关申请本申请要求于2017年3月28日提交的序列号为62/477,846的美国临时申请的优先权益，其全部内容在法律允许的最大范围内通过引用并入本文。
本专利技术涉及胶原酶生产和胶原酶产物的领域，特别涉及提高胶原酶I和胶原酶II组合物的再现性、纯度和稳定性，其中所述组合物经反相高压液相色谱(RP-HPLC)测量的纯度以面积计为至少95％，并且本质上不含中性蛋白酶。
技术介绍
先前在美国专利第7,811,560号中已经描述了一种用于从溶组织梭菌的发酵物中制造高纯度(至少95％的纯度)胶原酶的工艺。胶原酶I和II是分解胶原的酶，所述胶原是哺乳动物中最大量的结构蛋白。这些酶用于治疗多种胶原介导的疾病，例如，杜普伊特伦挛缩、佩罗尼氏病、脂肪瘤和粘连性关节囊炎。美国专利第6,086,872号和第5,589,171号公开了使用胶原酶制剂治疗杜普伊特伦疾病。美国专利第6,022,539号公开了使用胶原酶制剂治疗佩罗尼氏病。美国专利第6,958,150号和第7,842,673号公开了使用胶原酶用于治疗脂肪瘤。美国专利申请公开第2006/020448A1号公开了使用胶原酶治疗粘连性关节囊炎。美国专利申请公开号第2014/0335072号和第2016/0279046号公开了使用胶原酶用于治疗脂肪团。胶原酶的主要来源是溶组织梭菌的发酵物。包含溶组织梭菌胶原酶I和胶原酶II的可注射配方以商品名称出售并得到美国食品和药品管理局的批准，用于治疗杜普伊特氏挛缩和佩罗尼氏病。在欧洲和其他国家，所述可注射配方被称为胶原酶I和胶原酶II的氨基酸序列分别由colG和colH基因编码。colG的氨基酸序列描述于GenBankAcc.第D87215号和Matsushita等人(1999),细菌学杂志(JournalofBacteriology)181(3):923-933，并且colH的氨基酸序列描述于GenBankAcc.第D29981号和Yoshihara等人(1994),细菌学杂志(JournalofBacteriology)176(21):6489-6496。胶原酶AUXI具有由近似1000个氨基酸组成的单条多肽链，分子量为约113kDa。胶原酶AUXII也具有由约1000个氨基酸组成的单条多肽链，分子量为约112kDa。胶原酶I和胶原酶II是金属蛋白酶，并且需要紧密结合的锌和松弛结合的钙用于发挥它们的活性(EddieL.Angleton和H.E.VanWart,生物化学(Biochemistry)1988,27,7406-7412)。胶原酶I和胶原酶II都对所有类型的胶原具有广泛的特异性(Steinbrink,D；Bond,M和VanWart,H；(1985),JBC,260p2771-2776)。这些胶原酶通过在生理条件下水解胶原的三螺旋区域来消化胶原(Steinbrink,D；Bond,M和VanWart,H；(1985),JBC,260p2771-2776)。即使每种胶原酶显示出不同的特异性(即，每种具有不同的优选氨基序列用于分裂)，它们在一起也具有对胶原的协同活性(Mandl,I,(1964),生物化学(Biochemistry),3:p.1737-1741；Vos-Scheperkeuter,GH,(1997),细胞移植(CellTransplantation),6:p.403-412)。用于治疗的胶原酶可从包括哺乳动物、真菌以及细菌源的多种来源中获取。粗胶原酶的一种常见来源来自于细菌发酵工艺，特别是溶组织梭菌(C.histolyticum)的发酵。可以使用若干色谱技术中的任一种来纯化从溶组织梭菌中获取的粗胶原酶。然而，除了胶原酶之外，发酵液中还分泌了许多其他酶，其包括多种毒素。如先前在美国2015/0010532中所述，对来自溶组织梭菌菌株004的分泌毒素进行了基因组测序和分析，以研究这些毒素在生产胶原酶的发酵中的功能。经研究的毒素为α毒素(致命因子)、β毒素(I型和II型胶原酶)、γ毒素(梭菌蛋白酶)、δ毒素(中性蛋白酶)以及ε毒素(氧不稳定的溶血素)。根据基因组序列分析，仅胶原酶和梭菌蛋白酶被认为是菌株004的功能性毒素。其他毒素基于溶组织梭菌蛋白和相应模型蛋白之间的关键氨基酸序列差异被视为无功能。δ毒素，也称为中性蛋白酶(NP)，是一种来自溶组织梭菌的金属蛋白酶。中性蛋白酶是金属蛋白酶M4家族的成员，并且根据MEROPS肽酶数据库，中性蛋白酶与M4家族具有结构相似性，其包括通用序列基序、底物特异性以及辅因子需求。嗜热菌蛋白酶是M4家族中被研究最多，了解最多的酶。与该项研究相关的是，先前已对来自嗜热溶蛋白芽胞杆菌的嗜热菌蛋白酶进行了克隆和测序，并将信息收藏在GenBank中，登录号为CAA54291。嗜热菌蛋白酶是一种锌金属蛋白酶，其成熟酶分子量为34.6kDa。嗜热菌蛋白酶和M4肽酶家族的所有成员均由信号肽、前序列和成熟序列组成。当细胞产生嗜热菌蛋白酶时，它以无活性酶(酶原)开始，因为成熟酶序列之前的蛋白前序列会抑制嗜热菌蛋白酶。前顺序代表分泌的前酶大小的三分之二，而成熟酶则代表三分之一。嗜热菌蛋白酶中的前序列被自动催化裂解，导致成熟酶在其目的地环境中被激活。嗜热菌蛋白酶的分泌策略与中性蛋白酶共有，并且是得出以下结论的基础，溶组织梭菌中性蛋白酶也作为无活性蛋白酶开始。同样地，成熟形态的溶组织梭菌中性蛋白酶具有与嗜热菌蛋白酶相似的分子量，如在Herber(美国2015/0010532)中和在Maeda等人的《克隆溶组织梭菌中的中性蛋白酶，确定其底物特异性并且设计特异底物》，Appl.微生物.生物技术，99：10489-99(2015)中所述。嗜热菌蛋白酶在其合成、分泌、激活以及底物特异性的相似性使嗜热菌蛋白酶成为溶组织梭菌菌株004的中性蛋白酶的模型。尽管基于共有的结构特征，嗜热菌蛋白酶和中性蛋白酶之间的这些属性是相当的，但是序列差异确实存在于这两种酶之间。与本专利技术相关的是，在Herber(美国2015/0010532)中对δ毒素的先前基因馏分析和同源性与嗜热菌蛋白酶的比较得知，中性蛋白酶可能分泌到生长培养基中，但由于自催化位点中的分歧共有序列而无活性。嗜热菌蛋白(和所有中性蛋白酶)的性能特征是可以在大范围的蛋白质中起作用。药物中非特异性蛋白酶的存在，尤其是注射到体内的非特异性蛋白酶是有问题的，因为它们令人不希望地降解体内细胞和组织中的非靶向酶-即使微量存在。先前用于制作胶原酶的工艺有时会导致非典型胶原酶降解。为了高效和有效地商业制造胶原酶，需要可重复制造不含毒素的高纯度胶原酶。
技术实现思路
本公开提供了用于制造胶原酶的改进方法，其从胶原酶I和II产物中去除了可检测量的中性蛋白酶。本公开提供了一种胶原酶产物，所述胶原酶产物较不易降解，并且比先前医学使用的胶原酶组合物更纯。在一个实施方案中，进行了调查以鉴定在制造工艺中非典型胶原酶I和II从溶组织梭菌降解的原因。已经发现，来自溶组织梭菌的中性蛋白酶以其活性、成熟的形态存在于溶组织梭菌的发酵物中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药物产物，其包括经分离和纯化的胶原酶，其中所述药物产物本质上不含中性蛋白酶。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170328 US 62/477,8461.一种药物产物，其包括经分离和纯化的胶原酶，其中所述药物产物本质上不含中性蛋白酶。


2.根据权利要求1所述的药物产物，其中所述产物包括每毫克的所述产物少于约100纳克的中性蛋白酶。


3.根据权利要求1所述的药物产物，其中所述产物包括每毫克的所述产物少于约75纳克的中性蛋白酶。


4.根据权利要求1所述的药物产物，其中所述产物包括每毫克的所述产物少于约50纳克的中性蛋白酶。


5.根据权利要求1所述的药物产物，其中所述产物包括每毫克的所述产物少于约25纳克的中性蛋白酶。


6.根据权利要求1所述的药物产物，其中所述胶原酶包括源自溶组织菌的胶原酶I和胶原酶II。


7.根据权利要求1所述的药物产物，其中所述胶原酶是胶原酶I和胶原酶II中的至少一种。


8.根据权利要求7所述的药物产物，其中所述胶原酶I和胶原酶II以近似1：1的比例存在。


9.经分离和纯化的胶原酶I，其得自或源自溶组织梭菌，其中所述胶原酶I本质上不含中性蛋白酶。


10.根据权利要求9所述的胶原酶I，其中所述胶原酶I包括其量不可检测的中性蛋白酶。


11.根据权利要求9所述的胶原酶I，其中它包括每毫克胶原酶I中少于约1000纳克的中性蛋白酶。


12.根据权利要求9所述的胶原酶I，其中它包括每毫克胶原酶I中少于约500纳克的中性蛋白酶。


13.一种用于胶原酶I和胶原酶II的分离和纯化的方法，所述胶原酶I和胶原酶II得自或源自溶组织梭菌，其包括在胶原酶I和胶原酶II的纯化期间控制金属水平。


14.根据权利要求13所述的方法，其中工艺暴露于低水平的金属中，所述金属选自由镍、锌、铝、砷、钙、镉、铬、铜、铁、镁以及铅组成的群组。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述镍以小于约2.0ppm的量存在。


16.根据权利要求14所述的方法，其中所述镍以小于约1.2ppm的量存在。


17.根据权利要求14所述的方法，其中所述镍以小于约1.0ppm的量存在。


18.根据权利要求14所述的方法，其中所述镍以小于约0.5ppm的量存在。


19.根据权利要求14所述的方法，其中所述镍以选自由以下项组成的群组的量存在：小于约0.9ppm、小于约0.8ppm、小于约0.7ppm、小于约0.6ppm、小于约0.5ppm、小于约0.4ppm、小于约0.3ppm、小于约0.2ppm、小于约0.1ppm、小于约0.09ppm、小于约0.08ppm、小于约0.07ppm、小于约0.06ppm、小于约0.05ppm、小于约0.04ppm、小于约0.03ppm、小于约0.02ppm或小于约0.01ppm。


20.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约80ppm的量存在。


21.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约50ppm的量存在。


22.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约25ppm的量存在。


23.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约10ppm的量存在。


24.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约5ppm的量存在。


25.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约3ppm的量存在。


26.根据权利要求14所述的方法，其中所述锌以小于约1ppm的量存在。


27.一种制备经分离和纯化的胶原酶的方法，其包括在控制和限制金属含量的工艺中制备所述胶原酶，并且其中所述工艺包括消除步骤以从中性蛋白酶中分离多个高纯度的胶原酶馏分。


28.根据权利要求27所述的方法，其中所述胶原酶是胶原酶I，并且所述消除步骤分离出胶原酶I的馏分。


29.根据权利要求27所述的方法，其中所述胶原酶是胶原酶II，并且所述消除步骤分离出胶原酶II的馏分。


30.根据权利要求27所述的方法，其中所述胶原酶包括胶原酶I和胶原酶II，并且其中所述胶原酶I和胶原酶II的高纯度馏分被混合，并且其中所得到的混合物每毫克混合物具有小于50纳克的中性蛋白酶。


31.根据权利要求27所述的方法，其中所述工艺受限于低水平的金属，所述低水平的金属选自由镍、锌、铝、砷、钙、镉、铬、铜、铁、镁和铅组成的群组。


32.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是镍并且以小于约2.0ppm的量存在。


33.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是镍并且以小于约1.2ppm的量存在。


34.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是镍并且以小于约1.0ppm的量存在。


35.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是镍并且以小于约0.5ppm的量存在。


36.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是镍，并且以选自由以下项组成的群组的量存在：小于约0.9ppm、小于约0.8ppm、小于约0.7ppm、小于约0.6ppm、小于约0.5ppm、小于约0.4ppm、小于约0.3ppm、小于约0.2ppm、小于约0.1ppm、小于约0.09ppm、小于约0.08ppm、小于约0.07ppm、小于约0.06ppm、小于约0.05ppm、小于约0.04ppm、小于约0.03ppm、小于约0.02ppm或小于约0.01ppm。


37.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约80ppm的量存在。


38.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约50ppm的量存在。


39.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约25ppm的量存在。


40.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约10ppm的量存在。


41.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约5ppm的量存在。


42.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约3ppm的量存在。


43.根据权利要求31所述的方法，其中所述金属是锌并且以小于约1ppm的量存在。


44.根据权利要求31所述的方法，其中所述消除步骤包括测试在SDS-PAGE凝胶上的每个馏分，并且仅合并在所述凝胶上没有可检测量的中性蛋白酶的馏分。


45.一种制备经分离和纯化的胶原酶I的方法，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·A·谢弗，M·伯鲍姆，J·汉娜，J·德齐艾道斯，D·沙纳费尔特，
申请(专利权)人：恩多风投有限公司，C·A·谢弗，M·伯鲍姆，J·汉娜，J·德齐艾道斯，D·沙纳费尔特，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE