用于高水平生产CRM的改进方法技术

本发明专利技术提供了用于使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM197的改进方法，其中该方法包括使该菌株在具有一种或多种氨基酸的无动物来源组分的培养基中生长。

Improved method for high level production CRM

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高水平生产CRM的改进方法
本专利技术涉及使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化的白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株以高产率生产CRM197的改进方法。
技术介绍
CRM197是白喉毒素的遗传解毒的形式。在52位的单个突变用谷氨酸代替了甘氨酸，导致该天然毒素的ADP-核糖基转移酶活性丧失。缺乏毒性的CRM197的结构基础已经阐明，并广泛用作结合疫苗的载体蛋白。与白喉毒素一样，CRM197是由两个亚基(通过二硫桥键连接)组成的535个氨基酸(58.4KD)的单个多肽链。CRM197用作许多批准的结合疫苗如以商品名HibtiterTM销售的b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)结合物、以商品名销售的13价肺炎球菌多糖结合物等中的载体蛋白。RuthM.Drewetal.,Bacteriol.1951Nov；62(5):549-59；公开了适合生产高滴度白喉毒素的化学上限定的培养基并概述了Park-WilliamsNo.8的多伦多菌株白喉棒状杆菌的氨基酸需求。培养基含有有效替代动物来源组分即酪蛋白水解产物的氨基酸。氨基酸包括谷氨酸，胱氨酸，脯氨酸，色氨酸，亮氨酸，缬氨酸，蛋氨酸和甘氨酸。Rappuolietal；AppliedandEnvironmentalMicrobiology1983Vol.46(3):560-564已经公开，非串联双溶原菌(lysogen)是稳定的并能够提供高产量的CRM197，其比单溶原菌高多达三倍。>RFass.etal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology；April1995,Volume43(1):83-88；公开了一种从两种白喉棒状杆菌菌株：C7(β)(tox-201，tox-9)和C7(β)(tox-107)产生突变白喉毒素的高密度生长方法。这种方案涉及使用改良的非去铁(non-deferrated)的生长培养基，其提供细菌的快速且高密度的生长，并且当与同时消耗葡萄糖和铁结合时提高毒素生产。供应富氧空气以使细菌生长至在600nm(15-20g/L干重)下提供70的吸光度的细胞密度。培养物上清液中最大毒素浓度为150mg/L。ParagP.Nagarkaretal.,JournalofAppliedMicrobiology2002,92,215-220；公开了白喉棒状杆菌生长期间的氨基酸利用模式，并显示出所测试的九种氨基酸中只有四种，即胱氨酸，组氨酸，天冬氨酸和蛋氨酸对白喉棒状杆菌的生长和毒素产生是重要的。欧洲专利号1849860B1公开了使用非动物来源的蛋白材料如来自大豆、棉籽、土豆等的蛋白，作为病原细菌培养的培养基成分。美国专利号6,962,803B2公开了通过发酵能够产生白喉毒素的微生物菌株来纯化白喉毒素的方法，所述方法包括向生长的培养物中添加葡萄糖，由此葡萄糖的添加维持了有效支持白喉毒素生产的微生物生长。其进一步公开了，除了碳源之外，还有其他的生长的最低营养要求，包括微量金属，磷酸盐(磷酸酯，phosphate)，氮源，通常是酪蛋白氨基酸和酵母提取物。美国专利申请公开号2011/0097359A1公开了用于培养白喉棒状杆菌菌株以生产一定水平的白喉毒素或其类似物的培养基，其中培养基基本上不含动物来源产物，并且包含：水；碳水化合物源；氮源；和多种一定初始浓度的游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的初始浓度并不限制于白喉毒素或其类似物的生产水平。进一步公开了碳水化合物源不含葡萄糖。WO2006/100108A1公开了一种发酵方法，包括以下步骤：在足以维持均质培养和有限通气的搅拌条件下，在发酵罐内的培养基中培养白喉棒状杆菌菌株，使得培养物中的pO2对于大部分发酵步骤降至小于4％。进一步公开了通过通气程度将发酵罐内的pH保持于7.0至7.8，而无需添加酸或碱。CRM197过程通常对过程组分以及过程参数的细微变化敏感。尽管在商业实现方面取得了有限的成功，但在全球范围内使用了由白喉棒状杆菌的CRM197生产。上述参考文献均未公开采用工程化的白喉棒状杆菌菌株以高产率如>150mg/L生产CRM197的方法。本专利技术的专利技术人已经开发出使用工程化白喉棒状杆菌菌株用于CRM197的高产率生产的代谢流模型。本专利技术的目的本专利技术的主要目的是提供用于高水平生产CRM197的改进方法。本专利技术又一个目的是提供用于高水平生产CRM197的改进方法，该方法成本有效并能够用于生产结合疫苗。
技术实现思路
本专利技术提供了一种使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM197的改进方法，其中该方法包括使菌株在包含一种或多种氨基酸并且无动物来源组分的发酵培养基中生长。本专利技术提供了一种生产CRM197的改进方法，方法包括在不含动物来源的分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化的白喉棒状杆菌菌株，并向培养基补充营养物。本专利技术还提供了一种用于生产CRM197的改进方法，方法包括在不含动物来源的组分并且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化的白喉棒状菌株，和基于代谢流模型向培养基补充营养物。附图说明图1-命名为pBE33的质粒的构建图2-代谢流平衡模型流程图。具体实施方式本专利技术提供了使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM197的改进方法，其中方法包括使菌株在包含大于10种的氨基酸且无动物来源组分的发酵培养基中生长。本专利技术的工程化白喉棒状菌株(C7Ep)是指游离地(episomally)放置了由宿主CRM197基因的相同机制调控的CRM197基因的多个拷贝且所述菌株的遗传背景是单一溶源菌的白喉棒状杆菌。用于本专利技术的氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸和其盐，其每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。研究了氨基酸、维生素以及过程条件对于生产CRM197的影响。发现某些氨基酸对细菌的生长表现出负面影响。然而，发现如果以最佳浓度使用大于10种氨基酸，则CRM197的产量会增加。使用PlackettBurma设计的实验优化氨基酸浓度。PlackettBurman设计是使用有限数量的实验研究某些测量的量对多种独立变量(因数)的依赖性，以这种方式将这些依赖性的估计的方差最小化的实验设计。结果表明，氨基酸如天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸在35至36℃的温度下对CRM197合成有正面影响，而氨基酸如丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸在35至36℃的温度下对CRM197的合成具有负面影响。在不同浓度下进行几个水平的实验设计以实现高产量的CRM197。酪氨酸和天冬酰胺的使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于使用具有增加的CRM

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170422 IN 2017410143351.一种用于使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化的白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株以高产率生产CRM197的改进方法，其中所述方法包括使所述菌株在包含大于10种的氨基酸并且不含动物来源组分的发酵培养基中生长。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括向所述培养基补充营养物。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，补充营养物基于代谢流模型。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基包含苯丙氨酸、精氨酸和其他氨基酸的组合，其中苯丙氨酸和精氨酸的量小于约1g/L。


7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述营养物选自维生素如烟酸、硫胺素、泛酸、生物素、核黄素、叶酸；庚二酸；磷酸盐，氮源和微量金属。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述发酵培养基是非去铁的并且完全不含动物来源组分。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，发酵培养基组合物包含基础发酵培养基，所述基础发酵培养基包含酵母提取物，蔬菜蛋白胨，磷酸二氢钾(KH2PO4)，色氨酸，葡萄糖，YC微量盐溶液。


10.根据前述...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴拉穆拉利·马西拉马尼，拉扬·斯里拉曼，曼达尔·希里什·迪克西特，德维普拉萨纳·查卡，叙尔迪萨特亚姆·奈都，拉梅什·文卡特·马图尔，那伦德尔·德夫·曼特纳，马希玛·达特拉，
申请(专利权)人：生物E有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN