本发明专利技术公开了一种用HPSEC‑RI法检测肺炎链球菌荚膜多糖(pneumococcal capsular poly‑saccharides，PnPs)分子量的方法。步骤包括：配制流动相；精确称取PnPs，加入流动相溶解后，用流动相稀释，检测其粘度，使稀释后样品粘度值在一定范围内，过滤后作为供试品溶液；选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。该缓冲体系及样品处理的方法精确性高，重复性好。
A method to detect the molecular weight of pneumococcal capsular polysaccharide
【技术实现步骤摘要】
一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法。
技术介绍
目前，预防肺炎链球菌感染的上市疫苗有23价肺炎球菌多糖疫苗和7价/13价肺炎球菌多糖结合疫苗。肺炎链球菌荚膜多糖(pneumococcalcapsularpoly-saccharides，PnPs)是疫苗的主要有效成分，研究表明，PnPs的分子量大小直接影响多糖疫苗的免疫原性效果；而在结合疫苗中，PnPs作为疫苗的中间品也是质控的重要指标。截止2019年1月，国内有一家23价肺炎球菌多糖疫苗已上市，多个疫苗厂家正在研发肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗，但《中国药典》三部(2015版)尚未收录23价肺炎球菌多糖疫苗的制造和检定规程，《欧洲药典》7.0版收录的该疫苗制检规程规定使用凝胶排阻色谱法(size-exclusionchromatography，SEC)测定各型PnPs样品在色谱柱中的分配系数(KD)，并规定了各单价多糖的KD限值,但这种方法存在耗时、耗力、重复性差等缺点。在分子量测定方面，随着高效液相色谱技术日渐成熟，采用高效凝胶排阻色谱-示差折光法(highperformancesize-exclusionchromatogra-phywithrefractiveindex，HPSEC-RI)检测与待测样品性质相似的多糖分子量标准品，并以此绘制标准品分子量随样品洗脱时间或体积变化的质量分布曲线，记录待测样品的相应洗脱指标，通过质量分布曲线测算其分子量。经过大量实验证明，HPSEC-RI法在检测PnPs时，有些血清型PnPs稀释浓度越低，检测分子量结果越大，直到稀释至一定浓度后检测结果不再随浓度而变化。而PnPs的浓度和粘度有正相关的关系，统计所有PnPs的粘度和分子量的关系，得到溶液的粘度值在1.0-1.3cp之间时检测的分子量结果趋于统一。传统的HPSEC-RI法在检测PnPs时未考虑粘度因素的影响，存在较大误差，本专利技术优化了流动相，在样品稀释的过程中增加了粘度控制，从而提高HPSEC-RI法在检测PnPs的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法。处理后的样品用HPSEC-RI法检测肺炎链球菌荚膜多糖(pneumococcalcapsularpoly-saccharides，PnPs)分子量更准确的方法。本专利技术所述的检测方法，包括如下步骤：(1)配制0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液作为流动相；(2)精确称取PnPs加入到流动相后溶解，用流动相稀释，过滤后作为供试品溶液；(3)选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释至1mg/ml，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；(4)在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。其中，流动相为磷酸盐缓冲溶液，以配制1000ml总液量为例，配方为:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。其中，所述液相色谱分析所用的色谱柱为硅胶色谱柱，色谱柱为日本TOSOH株式会社，TSKG5000PWXL(7.8mmID×30cm)分析柱，HPSEC-RI检测条件为：监测器温度30℃，流速0.5ml/min，将分子量标准品分别用流动相配置成浓度为1mg/ml的溶液，各取100μl溶液进样。其中，针对不同血清型PnPs不同的粘度用流动相稀释至1mg/ml-0.02mg/ml，使溶液的粘度值在1.0-1.3cp之间，再进行高效凝胶排阻色谱-示差折光法(HPSEC-RI)检测其分子量大小。其中，此方法适用于所有肺炎链球菌PnPs。其中，肺炎链球菌血清型为1型、2型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型等粘度相对较小PnPs稀释至0.2mg/ml～2mg/ml，检测其粘度，应在1.0-1.3cp之间。其中，肺炎链球菌血清型3型PnPs稀释至0.05mg/ml～0.2mg/ml，检测其粘度，应在1.0-1.3cp之间。优选的，本专利技术的检测方法，包括以下步骤：(1)配制0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液作为流动相；(2)精确称取PnPs，加入流动相溶解12-24小时，用流动相稀释，多糖浓度为0.2mg/ml，3型应稀释至0.05mg/ml，摇匀后过滤，检测粘度应在1.0-1.3CP之间，即为供试品溶液；(3)选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释至1mg/ml，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；所述液相色谱检测条件为：试验温度30℃，系统流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min；(4)在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。进一步优选的，本专利技术的检测方法，包括以下步骤：(1)配制流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，以配制1000ml总液量为例，配方为:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。(2)建立标准曲线和回归方程将分子量标准品用流动相配置成浓度为0.2mg/ml的溶液，待测样品分别用流动相配置成相应浓度浓度各取100μl溶液进样。HPSEC-RI检测条件为：试验温度30℃，系统流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min。在线采集样品检测过程中的示差折光检测信号，用Empower3软件记录各样品在RI检测器上的峰尖保留时间。通过HPSEC-RI检测一系列已知分子量的标准品，以峰尖保留时间为横坐标，各标准品Mp的对数值(lgMp)为纵坐标建立分子量分布标准曲线及回归方程。(3)肺炎链球菌荚膜多糖稀释用稀释液溶解待测PnPs12-24小时，混匀后用流动相稀释多糖溶液至多糖浓度为0.2mg/ml，3型用流动相稀释至0.05mg/ml。用粘度计检测粘度，25℃粘度应在1.0-1.3CP之间。(4)分子量检测HPSEC-RI检测条件为：试验温度30℃，系统流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min。与标准品相同试验条件下检测并记录待测样品的峰尖保留时间，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的lgMp，并进一步获得其相应的分子量。本专利技术的检测方法的有益效果，主要体现在：现有的HPSEC-RI法在检测PnPs时未考虑粘度因素的影响，存在较大误差，本专利技术优化了流动相，在样品稀释的过程中增加了粘度控制，从而提高HPSEC-RI法在检测PnPs的准确性。本专利技术的检测方法相对于现有方法而言，还具有具有精确性高，重复性好，稳定性好等特点。附图说明<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法，包括如下步骤：配制流动相；精确称取PnPs加入到流动相后溶解，用流动相稀释，过滤后作为供试品溶液；选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释至1mg/ml，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法，包括如下步骤：配制流动相；精确称取PnPs加入到流动相后溶解，用流动相稀释，过滤后作为供试品溶液；选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释至1mg/ml，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相为磷酸盐缓冲溶液，以配制1000ml总液量为例，配方为:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱分析所用的色谱柱为硅胶色谱柱，色谱柱为日本TOSOH株式会社，TSKG5000PWXL(7.8mmID×30cm)分析柱，HPSEC-RI检测条件为：监测器温度30℃，流速0.5ml/min，将分子量标准品分别用流动相配置成浓度为1mg/ml的溶液，各取100μl溶液进样。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：针对不同血清型PnPs不同的粘度用流动相稀释至1mg/ml-0.02mg/ml，使溶液的粘度值在1.0-1.3cp之间，再进行高效凝胶排阻色谱-示差折光法(HPSEC-RI)检测其分子量大小。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：此方法适用于所有肺炎链球菌PnPs。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：肺炎链球菌血清型为1型、2型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型等粘度相对较小PnPs稀释至0.2mg/ml～2mg/ml，检测其粘度，应在1.0-1.3cp之间。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：肺炎链球菌血清型3型PnPs稀释至0.05mg/ml～0.2mg/ml，检测其粘度，应在1.0-1.3cp之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：马可，朱卫华，宗向坤，张霁，赵林飞，胡月凤，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，重庆智飞生物制品股份有限公司，安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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