细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法，其中通用引物包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种。实验表明，利用本发明专利技术的引物组检测待测细胞制品样本时，极大提高了真菌检测的通用性；同时也可避免检测目的片段与细胞制品中含有的人基因组序列的同源性，为细胞产品早期的检测提供了快速准确的方法。本发明专利技术的检测方法操作简单，无需复杂的核酸提取过程，只需将细胞制品中污染的真菌通过短暂离心富集后用裂解液裂解即可作为模板进行定量PCR检测，能够在3小时内完成细胞制品中常见真菌的检测。

Universal primers, kits and detection methods for detection of fungal contamination in cell products

【技术实现步骤摘要】
细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
近年来，随着细胞疗法研究的迅速发展，体外的细胞培养已成为细胞治疗过程中的一个重要环节。在细胞培养过程中，细菌、真菌以及支原体等的污染严重影响了细胞生长。按照2015年版《中国药典》的无菌检查法，供试品的无菌检查需要在规定的培养基和适宜的温度下培养14天，在实验过程中需要做好各项实验对照，同时实验要求较为严格，并且在培养过程中每日观察并记录培养的平皿中是否有真菌生长。药典中的检测方法在检测时间上要求的时间较长，待到培养法检测得出结论时，细胞培养过程中也早已能够观察出来。因此，需要一种快速灵敏的方式来检测细胞培养过程中是否存在真菌污染。实时荧光定量PCR技术作为一种新兴的检测手段，其在检测过程中具灵敏度高、重复性好、检测时间短等优点，已逐渐被应用到病原菌检测中。真菌基因组中编码核糖体RNA的基因有4种，26SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA。26S在结构上分为保守区和高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。真菌的26SrDNA具有一定的保守性，保守区序列是大部分真菌所共有的，该段序列用于真菌的检测可以避免和细菌、人的基因发生交叉反应，具有很强的特异性。真菌大亚基上的26SrDNA分子，可分为D1、D2…D12等多个区域，其中D1/D2区域序列长度适中，是目前流行的真菌分子鉴定和系统发生分析标记，同时也可适用于定量PCR的方法对真菌进行检测。
技术实现思路
针对现有技术中的技术空白，本专利技术的目的是提供一种细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法，该方法对常见真菌检测通用性强，基于荧光定量PCR技术，在引物设计上避免了扩增的序列在细胞制品自身核酸上的同源性，解决了定量PCR检测中的假阳性问题，提高了检测结果的可靠性。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的是提供一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物序列与真菌26SrDNA序列的保守区域互补，所述上游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3中的至少一种，所述下游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5中的一种或两种。进一步地，组成所述引物组的各条引物的单链DNA分子的物质的量相等。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测细胞制品中真菌污染的试剂盒，所述试剂盒包含有上述任一项所述的通用引物组和PCR预混液。进一步地，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的第三个目的是提供上述任一项所述的通用引物，或上述任一项所述的试剂盒在细胞培养液、细胞培养基真菌污染检测中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，包括：(1)以带有标准序列的质粒为模板进行荧光定量PCR，建立标准曲线，所述标准序列如SEQIDNO.6所示，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5中的一种或两种；(2)供试品处理，获得荧光定量PCR供试品模板；(3)扩增检测：以步骤(2)中的模板为扩增模板进行荧光定量PCR，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5中的一种或两种；(4)荧光定量结果分析：根据供试品的样本基因组DNA中的靶标扩增Ct值来判断供试品中是否存在真菌污染。进一步地，所述步骤(2)中供试品处理方法为：取细胞制品进行短暂离心富集后，再使用裂解液裂解直接获得供试品模板。进一步地，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃3min预变性；以95℃10s，58℃10s，72℃30s为一个循环，共40个循环。进一步地，所述方法中设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为裂解液裂解酵母后的溶液，所述阴性对照为无菌去离子水。进一步地，所述方法中设置阳性干扰品，所述阳性干扰品为等体积的供试品中添加酵母菌液形成的；所述阳性干扰品处理方法为：取阳性干扰品进行短暂离心富集后，再使用裂解液裂解直接获得阳性干扰品模板。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果如下：(1)本专利技术的技术方案通过设计通用引物，运用实时荧光定量PCR技术实现了对常见真菌通用检测的目的，有效地解决了以往PCR方法只能用于检测单一真菌的问题，同时也避免了检测目的片段与细胞制品中含有的人基因组序列的同源性，极大提高了真菌检测的通用性，为细胞产品早期的检测提供了快速准确的方法。(2)本专利技术的检测方法操作简单，无需复杂的核酸提取过程，只需将细胞制品中污染的真菌通过短暂离心富集后用裂解液裂解后即可作为模板进行定量PCR检测，能够在3小时内完成细胞制品中常见真菌的检测。附图说明图1为实施例1中SEQIDNO.1所示上游引物与参考序列比对结果示意图；图2为实施例1中SEQIDNO.2所示上游引物与参考序列比对结果示意图；图3为实施例1中SEQIDNO.3所示上游引物与参考序列比对结果示意图；图4为实施例1中SEQIDNO.4所示下游引物与参考序列比对结果示意图；图5为实施例1中SEQIDNO.5所示下游引物与参考序列比对结果示意图；图6为实施例2中重组克隆质粒荧光定量PCR扩增曲线；图7为实施例2中重组克隆质粒荧光定量PCR标准曲线；图8为实施例2中念珠菌荧光定量PCR扩增曲线；图9为实施例2中念珠菌荧光定量PCR标准曲线；图10为实施例2中黑曲霉菌荧光定量PCR扩增曲线；图11为实施例2中黑曲霉菌荧光定量PCR标准曲线；图12为实施例2中待测样本的荧光定量PCR检测结果示意图。图13为实施例3中重组克隆质粒荧光定量PCR扩增曲线；图14为实施例3中重组克隆质粒荧光定量PCR溶解曲线；图15为实施例3中重组克隆质粒荧光定量PCR标准曲线；图16为实施例3中待测样本的荧光定量PCR检测结果示意图。具体实施方式下面申请人结合具体实施例对本专利技术技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为本专利技术请求保护范围的限定。实施例1：用于快速检测细胞制品中真菌污染的荧光PCR引物的获得一、引物对的设计与合成本专利技术的细胞制品真菌快速检测方法中，上下游PCR引物序列是从真菌26SrDNA序列的保守区域中筛选得到的通用引物，在NCBI(https:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，其特征在于，包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物序列与真菌26S rDNA序列的保守区域互补，所述上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，所述下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种。/n

【技术特征摘要】
20190125 CN 20191007387801.一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，其特征在于，包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物序列与真菌26SrDNA序列的保守区域互补，所述上游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3中的至少一种，所述下游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5中的一种或两种。


2.根据权利要求1所述的一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，其特征在于，组成所述引物组的各条引物的单链DNA分子的物质的量相等。


3.用于检测细胞制品中真菌污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1-2任一项所述的通用引物组和PCR预混液。


4.根据权利要求3所述的一种用于检测细胞制品中真菌污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品序列如SEQIDNO.6所示。


5.权利要求1-2任一项所述的通用引物，或权利要求3-4任一项所述的试剂盒在细胞培养液、细胞培养基真菌污染检测中的应用。


6.一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，其特征在于，包括：
(1)以带有标准序列的质粒为模板进行荧光定量PCR，建立标准曲线，所述标准序列如SEQIDNO.6所示，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3中的至少一种，下游引物选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡萌，毛伟兵，魏君，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42