一种叶绿体DNA的富集方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，特别涉及一种叶绿体DNA的富集方法。本发明专利技术的方法基于植物细胞中的叶绿体DNA与细胞核DNA甲基化位点存在的差异，利用带有蛋白A修饰的磁珠，通过MBD2‑Fc蛋白媒介，将植物基因组DNA中的细胞核DNA和叶绿体DNA进行分离，并进一步实现对叶绿体DNA的富集。利用本发明专利技术的方法，在测序前进行叶绿体DNA的富集，然后对富集后的叶绿体DNA进行测序，可有效提高测序数据中叶绿体DNA序列的比例，显著提高测序的准确度、降低测序成本。

A method of chloroplast DNA enrichment

【技术实现步骤摘要】
一种叶绿体DNA的富集方法
本专利技术属于分子生物学
，特别涉及一种植物叶绿体DNA的富集方法。
技术介绍
叶绿体DNA测序已经被广泛应用于分类学和系统进化的研究，完整的叶绿体DNA测序可以为复杂的进化关系提供有用的依据，提高物种的分类水平。与细胞核基因组相比，叶绿体基因组是母系单方面遗传，在进化变异速度上较慢。通过二代测序发现的叶绿体基因组中的SNP和插入缺失突变可能成为未来不同分类水平上的分子标记。植物的大多数遗传物质都来源于细胞核，只有很少一部分来源于其他细胞器，所以对植物基因组进测序所得到的数据信息大多来源于细胞核DNA，而检测到的叶绿体DNA非常少，特别是对于基因组较大的物种，例如水稻、小麦等，叶绿体DNA所占的比例就更少。将植物基因组DNA进行二代测序，从中过滤掉其他信息，筛选出叶绿体DNA信息的方法对与基因组较大的物种成本过高。这就需要我们寻找有效的方法去除植物细胞核DNA的干扰，获得更多的叶绿体DNA。在现有的DNA提取方法的基础上优化提取过程中盐离子浓度和pH值所得到的叶绿体DNA存在细胞核DNA残留，质量降低等问题，很难满足后续测序要求。此外，如采用蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体DNA，耗时长，操作繁琐，产率低，对设备要求高，密度梯度液不易保持。而采用DNaseI法提取叶绿体DNA，则药品较贵，提取时间长，难以使叶绿体膜保持完整，导致叶绿体DNA的得率很低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种叶绿体DNA的富集方法，以实现更高效率地针对植物的叶绿体DNA进行测序或其他分子生物学研究。为解决上述技术问题，本专利技术所提供的叶绿体DNA的富集方法，包括：(1)提取植物基因组DNA；(2)使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合，得到处理后的磁珠；(3)将所述植物基因组DNA加入所述处理后的磁珠中，混匀，对混合物进行室温下孵育；(4)对孵育后的混合物离心，于磁力架上静置，细胞核DNA通过与磁珠上的MBD2-Fc蛋白结合而附着到磁珠上，叶绿体DNA保留在上清液中，取上清液；(5)使用磁珠对所述上清液中的叶绿体DNA进行回收。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下的有益效果：本专利技术的申请人提出，植物细胞中细胞核DNA与叶绿体DNA的甲基化位点存在差异：植物细胞核DNA上存在很多甲基化位点，叶绿体DNA上的甲基化位点则非常少。而MBD2-Fc蛋白由两部分组成：MBD2蛋白可以特异地跟甲基化的CpG结合，Fc是人类IgG上的Fc片段，它可与磁珠上的蛋白A结合。申请人利用带有蛋白A修饰的磁珠，通过MBD2-Fc蛋白媒介，将植物基因组DNA中的细胞核DNA和叶绿体DNA分离，并进一步实现对叶绿体DNA的富集。利用本专利技术的方法，即可通过简便的操作、快速地在测序前对植物细胞中的细胞核DNA与叶绿体DNA进行分离、并对叶绿体DNA进行富集，然后对富集后的叶绿体DNA进行测序，可有效提高测序数据中叶绿体DNA序列的比例，显著提高测序的准确度、降低测序成本。优选地，步骤(1)中，在提取植物基因组DNA时，保证所述植物基因组DNA的完整性，并且完全去除植物蛋白，以免影响后续蛋白相互结合的实验。优选地，步骤(1)中，提取植物基因组DNA可使用试剂盒或其他植物基因组DNA的提取方法，例如可以选用的提取方法为：对待提取样本使用蛋白酶K处理，然后用酚氯仿或酒精提取。优选地，步骤(1)中，还包括对提取的植物基因组DNA进行质量检测的步骤和/或对提取的植物基因组DNA进行纯化的步骤。进一步优选地，所述对提取的植物基因组DNA进行质量检测的步骤包括浓度检测、有无降解检测、杂质检测中的一种或多种。具体来说，对提取的植物基因组DNA的质量检测中，一般使用Qubit、1％的琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop分别对它的浓度、完整性、纯度进行检测。对提取的植物基因组DNA进行浓度测定应保证总量不少于1μg。如有检测结果显示提取的植物基因组DNA中含有杂质，则需对提取的基因组DNA进行纯化。优选地，步骤(2)中，所述蛋白A为从A型金黄色葡萄球菌分离得到的一种细胞壁蛋白。蛋白A修饰的磁珠是磁珠上结合有蛋白A，蛋白A是从A型金黄色葡萄球菌分离而得到的一种细胞壁蛋白，可以与人类大多数类型的IGg的Fc段结合。优选地，步骤(2)中，使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合的方法为：取蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白混合，室温中孵育10～15分钟。优选地，步骤(2)中还包括除去未结合的MBD2-Fc蛋白的步骤。优选地，步骤(3)中，加入到所述处理后的磁珠中的植物基因组DNA的总量不超过1μg，如加入的植物基因组DNA总量过多，会影响细胞核DNA的去除效率。优选地，步骤(3)中，所述室温下孵育的时间为15～20分钟。另外，根据本专利技术的方法分离得到的植物细胞核DNA也可以用蛋白酶K将其洗脱下来，用于其他实验。附图说明图1为本专利技术具体实施方式的PCR扩增对比实验中的Marker的电泳图；图2为本专利技术具体实施方式的PCR扩增对比实验中样品1、2的电泳图；图3为本专利技术具体实施方式的PCR扩增对比实验中样品3、4的电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清晰明了，下面结合具体实施例对专利技术进一步详细说明。这些描述只是示例性的，并非限制本专利技术的范围。以下说明中，省略了对已知结构和技术的描述。1.叶绿体DNA富集实验本实施例是对植物叶绿体DNA进行富集的具体步骤的一个举例，其中所使用的所有蛋白和试剂都应放在冰上；其中所使用的试剂都可以通过商购获得，例如蛋白A修饰的磁珠、MBD2-Fc蛋白、5×BindingBuffer是购于NEWENGLANDBIOLABS，用于DNA回收的磁珠AgencourtAMPureXP购于Beckman。(1)取适量新鲜的小麦叶片进行基因组DNA的提取，为了获得高质量的DNA，本实施例中采用试剂盒(天根：植物基因组DNA提取试剂盒DP305)提取；(2)对提取的植物基因组DNA进行质量检测，用Qubit的方法检测它的浓度，总量应大于1μg，用Nanodrop检测它的纯度，它的ODA260/OD280约为1.8～2.0，OD260/OD230约为0.4～0.5，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测它的片段是否完整；(3)取160μl蛋白A修饰的磁珠(4℃保存)与16μlMBD2-Fc蛋白混合于1.5ml的离心管中，用枪头轻轻吹打混匀，放于旋转混匀仪上室温孵育10分钟，让磁珠上的蛋白A与MBD2-Fc蛋白上的Fc片段结合；(4)将步骤(3)的所得的磁珠稍微离心后放于磁力架上静置5分钟，直到磁珠完全吸附到磁力架上；(5)去除磁珠中的上清，加入1ml1×BindingBuffer(提前放于冰上解冻)，用枪头混匀重放于磁力架上静置5分钟后去上清；(6)重复步骤(5)，并用160μl的1×BindingBuffe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种叶绿体DNA的富集方法，其特征在于，包括：/n(1)提取植物基因组DNA；/n(2)使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合，得到处理后的磁珠；/n(3)将所述植物基因组DNA加入所述处理后的磁珠中，混匀，对混合物进行室温下孵育；/n(4)对孵育后的混合物离心，于磁力架上静置，细胞核DNA通过与磁珠上的MBD2-Fc蛋白结合而附着到磁珠上，叶绿体DNA保留在上清液中，取上清液；/n(5)使用磁珠对所述上清液中的叶绿体DNA进行回收，即得到富集后的叶绿体DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种叶绿体DNA的富集方法，其特征在于，包括：
(1)提取植物基因组DNA；
(2)使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合，得到处理后的磁珠；
(3)将所述植物基因组DNA加入所述处理后的磁珠中，混匀，对混合物进行室温下孵育；
(4)对孵育后的混合物离心，于磁力架上静置，细胞核DNA通过与磁珠上的MBD2-Fc蛋白结合而附着到磁珠上，叶绿体DNA保留在上清液中，取上清液；
(5)使用磁珠对所述上清液中的叶绿体DNA进行回收，即得到富集后的叶绿体DNA。


2.根据权利要求1所述的叶绿体DNA的富集方法，其特征在于，步骤(1)中，在提取植物基因组DNA时，保证所述植物基因组DNA的完整性，并且完全去除植物蛋白。


3.根据权利要求1所述的叶绿体DNA的富集方法，其特征在于，步骤(1)中，提取植物基因组DNA的方法为：对待提取样本使用蛋白酶K处理，然后用酚氯仿或酒精提取。


4.根据权利要求1所述的叶绿体DNA的富集方法，其特征在于，步骤(1)中，还包括对提取的植物基因组DNA进行质量检测的步骤和/或对提取的植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：林芹，龙欢，袁方，陶晔，曾亮，林爱婷，
申请(专利权)人：上海凌恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31