一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用，属于生物医药技术领域，融合蛋白为PTA或者PTR中的一种，且融合蛋白其中一部分为PD‑1的抑制剂，另一部分为TGF‑β的抑制剂。本发明专利技术针对肿瘤内部抑制性微环境，设计了新型融合蛋白PTA和PTR，PTA和PTR能够同时抑制PD‑1和TGF‑β信号通路，单独使用或者联合CAR‑T用于实体瘤的治疗，使得CAR‑T细胞靶向实体瘤的同时，分泌抑制PD‑1/PD‑L1信号通路和TGF‑β信号通路的融合蛋白，具有更强的解除免疫抑制微环境，治疗肿瘤的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用
本专利技术涉及生物医药
，更具体地说，它涉及一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在血液系统肿瘤的治疗中取得了显著的疗效，尤其是靶向CD19的CAR-T疗法，已经有两款产品被FDA批准上市。但是CAR-T疗法在实体瘤治疗中仍未有大的进展，其疗效不太显著的一个重要原因是实体肿瘤的免疫微环境过于复杂，具有很强的抑制T细胞活力的能力，从而导致T细胞在实体肿瘤内不能有效增殖，耗竭过后，导致不能起到杀伤肿瘤组织的能力。免疫检查点是一类表达在T细胞表面的抑制性受体，其与配体的结合会导致T细胞功能的耗竭。PD-1是当前研究较为深入的免疫检查点之一，通过PD-1抑制剂阻止PD-1与其配体PD-L1的结合，从而拯救T细胞耗竭表型，恢复T细胞杀伤肿瘤的能力。临床结果也显示PD-1抑制剂在多种实体瘤中有疗效，但是有效率仅为20％左右。TGF-β是实体瘤组织中常见抑制性细胞因子，其以自分泌或是旁分泌的方式通过细胞表面的受体信号传导途径参与细胞的调节作用，主要包括抑制免疫作用，使肿瘤细胞逃避免疫监视。TGF-β抑制白细胞介素2的产生，从而抑制T细胞增殖、分化及其细胞毒性，最终促进肿瘤的生长。有研究表明TGF-β能够抑制NK细胞增殖及其受体的表达，从而抑制NK-cell毒性。TGF-β因其具有重要的促肿瘤作用，而被认为是治疗的理想靶点。TGF-β受体有三种类型分别为：TGF-βRI、RII、RIII，其中只有在I型和II型同时表达时才能转导信号至细胞内，TGF-βIII型不直接参与信号转导。TGF-β信号转导第一步是TGF-βRII自身被磷酸化，进而激活其氨基酸残基ser213及ser409，而后与TGF-βI相互作用，激活TGF-βI，最终通过smads蛋白将信号直接转导至细胞核内。鉴于TGF-βII在信号转导的关键作用，因此阻断TGF-β信号转导，TGF-βII受体更加理想。TGF-β三种受体均含有胞外区、跨膜区、胞内区，通过在受体胞外区容易阻断TGF-β信号转导，进而抑制TGF-β信号转导，起到解除免疫抑制作用。鉴于CAR-T在实体瘤治疗中由于免疫微环境导致疗效受限和PD-1抗体单药使用中的局限性，我们开发出整合了CAR-T、PD-1抑制剂、TGF-β抑制剂的新型免疫疗法，使得CAR-T细胞靶向实体瘤的同时，分泌抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGF-β信号通路的融合蛋白，可能有更强的解除免疫抑制微环境，治疗肿瘤的能力。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用，针对肿瘤内部抑制性微环境，设计了新型融合蛋白PTA和PTR，PTA和PTR能够同时抑制PD-1和TGF-β信号通路，单独使用或者联合CAR-T用于实体瘤的治疗。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，所述融合蛋白为PTA或者PTR中的一种，所述融合蛋白其中一部分为PD-1的抑制剂，另一部分为TGF-β的抑制剂。进一步地，所述PD-1的抑制剂为PD-1抗体。进一步地，所述TGF-β的抑制剂为TGF-β抗体或者TGFBRII的胞外区片段。进一步地，所述融合蛋白为PTA，所述PTA的一部分为PD-1抗体，另一部分为TGF-β抗体，所述PTA氨基酸序列为SEQIDNO.1。进一步地，所述融合蛋白为PTR，所述PTR的一部分为PD-1抗体，另一部分为TGFBRII的胞外区片段，所述PTR氨基酸序列为SEQIDNO.2。编码上述氨基酸序列的DNA序列。一种载体，编码上述的DNA序列。一种细胞，稳定或瞬时表达上述的载体。上述的氨基酸、DNA、载体和细胞在人类肿瘤治疗中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术解决了CAR-T细胞在实体瘤治疗中疗效有限、PD-1有效率不高的问题，针对肿瘤内部抑制性微环境，设计了新型融合蛋白PTA和PTR，PTA和PTR能够同时抑制PD-1和TGF-β信号通路，单独使用或者联合CAR-T用于实体瘤的治疗，使得CAR-T细胞靶向实体瘤的同时，分泌抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGF-β信号通路的融合蛋白，具有更强的解除免疫抑制微环境，治疗肿瘤的能力。附图说明图1为CARL6-PTA和CARL6-PTR分子结构示意图；图2为CAR-T细胞阳性率的谱图；图3为A549细胞TM4SF1阳性率的谱图；图4为不同CAR-T细胞杀靶细胞A549能力的谱图；图5为回输后小鼠外周血CAR-T细胞数量的谱图；图6为回输后小鼠瘤体生长曲线。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的实施方式不仅限于此。如图1-6所示，一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，融合蛋白为PTA或者PTR中的一种，融合蛋白其中一部分为PD-1的抑制剂，另一部分为TGF-β的抑制剂。优选地，PD-1的抑制剂为PD-1抗体；TGF-β的抑制剂为TGF-β抗体或者TGFBRII的胞外区片段。当融合蛋白为PTA时，PTA的一部分为PD-1抗体，另一部分为TGF-β抗体，且PTA氨基酸序列为SEQIDNO.1。当融合蛋白为PTR时，PTR的一部分为PD-1抗体，另一部分为TGFBRII的胞外区片段，且PTR氨基酸序列为SEQIDNO.2。编码上述氨基酸序列的DNA序列。一种载体，编码上述的DNA序列。一种细胞，稳定或瞬时表达上述的载体。氨基酸、DNA、载体和细胞在人类肿瘤治疗中的应用。实施例一：本实施例中构建了带有PTA或者PTR表达的CAR分子CARL6-PTA或CARL6-PTR。其中PTA为由anti-PD1scFv和anti-TGFβscFv通过柔性GS连接肽链接而成的融合蛋白；PTR为由anti-PD1scFv和sTGFBRII通过柔性GS连接肽链接而成的融合蛋白；sTGFBRII为TGFBRII的胞外区序列。其具体分子结构示意图如图1所示。CARL6-PTR载体构建：首先我们通过基因合成得到anti-PD1scFv质粒和sTGFBRII序列质粒，通过PCR的方式将PD1抗体序列和sTGFBRII序列分别扩增出来，再通过搭桥PCR的方式将PD1抗体序列和sTGFβRII序列拼接到一起，并在中间添加柔性连接多肽，构建成完整的anti-PD1scFv-sTGFBRII序列(标记为PTR)。用ClaI单酶切编码CARL6的慢病毒载体pHAGE-CARL6，得到带有粘性末端的载体片段，将PTR用重组酶连接到上述单酶切载体中，50℃反应20分钟，随后转化stbl3感受态细胞。第二天接种单菌落至LB扩增培养，并提取质粒。通过酶切和测序验证其序列，留下正确的质粒命名为pHAGE-CARL6-PTR进行下一步实验。CARL6-PTA载体构建：首先我们通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为PTA或者PTR中的一种，所述融合蛋白其中一部分为PD-1的抑制剂，另一部分为TGF-β的抑制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为PTA或者PTR中的一种，所述融合蛋白其中一部分为PD-1的抑制剂，另一部分为TGF-β的抑制剂。


2.根据权利要求1所述的一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1的抑制剂为PD-1抗体。


3.根据权利要求2所述的一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，其特征在于，所述TGF-β的抑制剂为TGF-β抗体或者TGFBRII的胞外区片段。


4.根据权利要求3所述的一种用于解除免疫抑制的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为PTA，所述PTA的一部分为PD-1抗体，另一部分为TGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝瑞栋，刘根桃，易桥勇，李彦涛，红丽，吴国详，
申请(专利权)人：上海科棋药业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31