口蹄疫A型合成肽疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗及其制备方法和应用。口蹄疫A型合成肽疫苗包括抗原多肽组合物，抗原多肽组合物包括序列1和序列2所示的多肽。本发明专利技术提供的口蹄疫合成肽疫苗具有良好的免疫效力，且疫苗的抗原为化学合成多肽，不含口蹄疫病毒核酸粒子，安全性高。因此本发明专利技术的疫苗可以有效应对目前口蹄疫流行毒株、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。本发明专利技术还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。

Synthesis peptide vaccine of foot-and-mouth disease a and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
口蹄疫A型合成肽疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于医药
，具体而言，本专利技术涉及一种口蹄疫合成肽疫苗，以及其制备方法。
技术介绍
口蹄疫(footandmouthdisease，简称FMD)是一种偶蹄动物发生的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。口蹄疫的传染性高，传播迅速，感染猪、猪、羊等牲畜后将导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，因此严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。目前，口蹄疫使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的。口蹄疫病毒属于细小核糖核酸病毒，具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒：A、O、C、Sat1(南非I型)、Sat2(南非II型)、Sat3(南非III型)和AsiaI(亚洲I型)。这些主型中的每一种又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和AsiaI型的口蹄疫病毒最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明，口蹄疫病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的，每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清型中抗原差异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。当前在我国猪群中流行的口蹄疫主要是O型和A型口蹄疫。我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比之下，目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。由此可见，在口蹄疫防治方面，我国已落后于世界发展形势。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸多问题，影响了这些新型疫苗的使用。此外，这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差，不能有效地保护动物。因此，本领域仍然存在对于安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽，多肽组合物，以及含有该多肽组合物的疫苗。为实现上述目的，本实验室根据口蹄疫A型流行毒的抗原表位设计了2条氨基酸组成的多肽序列，分别为序列表中序列1和序列2所示的多肽。采用固相法合成，与ISA50V佐剂混合制成油乳剂疫苗。通过效力试验证明，口蹄疫A型合成肽疫苗针对AF/72强毒攻击的PD50值均超过6，达到保护要求，具有保护试验动物猪免受病毒攻击的能力。安全性试验证明口蹄疫合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及猪无副反应出现，安全性高，无散毒危险，所以具有良好的推广前景和市场价值。合成肽疫苗极大的提高了安全性和特异性，并且其制备工艺更简单、生产成本更低廉、疫苗质量更加可靠，利于规模化生产。作为一种新型口蹄疫疫苗，其优点可以为企业和市场带来新的竞争力和经济增长点，市场空间巨大。本专利技术采用了以下技术方案：本专利技术提供一种用于制备口蹄疫合成肽疫苗的抗原多肽，为序列表中序列1或序列2所示的多肽。本专利技术提供的用于制备口蹄疫合成肽疫苗的抗原多肽组合物，包括序列表中序列1所述多肽和序列表中序列2所述多肽的组合物。本专利技术中所述的多肽片段可以是通过固相有机合成得到的肽物质。当选取两种序列所述的多肽组合物组成疫苗时，它们的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5)；最优选的，它们的摩尔比为1:1。所述的多肽组合物在制备口蹄疫合成肽疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供的一种口蹄疫合成肽疫苗，包含上述的多肽组合物。所述肽疫苗还包含佐剂。本专利技术提供了所述的口蹄疫合成肽疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)用注射用水将所述多肽组合物稀释为10-100μg/ml(优选50μg/ml)的浓度，从而得到多肽抗原水相；(2)将佐剂灭菌(在121℃条件下灭菌30分钟)；(3)在20～28℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在90～150rpm下搅拌1.5～3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅拌20～30分钟，再在8000～10000rpm下搅拌15-30分钟，静置3-10分钟(优选5分钟)，分装。优选地，所述佐剂为选自白油、50V、50VII(MONTANIDEISA50V、50VII佐剂(法国SEPPIC公司))中的一种或多种。本专利技术还提供了上述多肽聚合物中的多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；(2)合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；(3)使用乙醚沉淀所述多肽；(4)对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。在上述制备方法中，所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-a)脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15％～30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20～28℃条件下反应25～40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；(1-b)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；(1-c)缩合反应：加入1-羟基苯丙三氮唑(HOBT)、二异丙基碳二亚胺(DIC)与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20～28℃条件下反应0.5～2.5小时；(1-d)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；(1-e)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％～4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20～28℃条件下反应20～40分钟。在上述制备方法中，所述步骤(2)中裂解试剂的组分为体积比为85:8::6:1的三氟乙酸:三异丙基硅烷:苯酚:水；并且，所述步骤(2)的裂解时间为1-4小时。在上述制备方法中，所述步骤(3)具体包括：(3-a)使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；(3-b)在加入10％的DMSO情况下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键；或者，使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；优选地，在加入1％的DIC和0.5％的HOBT情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在0.1MH2SO4情本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽组合物，包括序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽组合物，包括序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。


2.根据权利要求1所述的用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽组合物，所述用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗的多肽组合物，由序列1所示多肽和序列2所示多肽组成。


3.根据权利要求2所述的口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽组合物，其中，序列1所示的多肽、序列2所示的多肽的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5)。


4.根据权利要求3所述的口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽组合物，其中，序列1所示的多肽、序列2所示的多肽的摩尔比为1:1。


5.口蹄疫A型合成肽疫苗，包括权利要求1-5中任意一项所述的口蹄疫A型合成肽疫苗的抗原多肽组合物。


6.根据权利要求5所述的口蹄疫A型合成肽疫苗，其特征在于，还包括药学上可接受的佐剂。


7.用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冬荀，蔡薇，肖进，向王震，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11