用于片形吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CL7重组蛋白，本发明专利技术还公开了CL7重组蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术还公开了表达盒、重组载体或重组菌株，其含有所述的核酸或基因。本发明专利技术还公开了所述的CL7重组蛋白、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或重组菌株在制备检测片形吸虫试剂盒方面的应用。本发明专利技术公开了用于片形吸虫诊断的ELISA试剂盒。本发明专利技术的试剂盒酶标检测抗体通过HRP标记的抗体来进一步发挥信号放大效果增加反应的灵敏度，同时降低检测抗体的用量和成本；不受其他血清的干扰，交叉反应小，敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原，完全适合于片形吸虫病的现场筛查。

ELISA kit for diagnosis of Fasciola flaccida and its application

【技术实现步骤摘要】
用于片形吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及人畜共患病的检测领域，涉及用于片形吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒及其应用。
技术介绍
片形吸虫病是由吸虫纲片形科、片形属的肝片吸虫(Fasciolahepatica)和大片吸虫(Fasciolagigantica)引起的一类人兽共患病，呈世界性分布，中国各地广泛存在。除侵害牛、羊外，尚可感染马、驴、驼、狗、猫、猪、兔、鹿以及多种野生动物和人。WTO表示片形吸虫病在51个国家新兴，超过170万-240万人感染了这种人畜共患病，并且有1.8亿人可能面临受感染的危险。同时该病对畜牧业也有很大影响，严重影响农牧家庭收入，甚至危及粮食卫生安全和公共卫生安全。片形吸虫的分泌代谢物中有多种有效抗原成分，这些抗原成分在虫体感染人体后会诱发多种免疫病理反应。而组织蛋白酶家族在片形吸虫的分泌抗原中含量较高，具有众多成员，在片形吸虫的发育及感染等方面具有重要意义。传统上，使用患者粪便中片形吸虫虫卵的病原学方法检测片形吸虫病。但是，该方法费时费力，且漏检率高，而且这种方法不能对该病进行早期诊断。近年来，免疫检测的方法逐渐被用于片形吸虫病的临床诊断研究中来，并取得了良好的效果。目前实验室和临床应用的免疫学诊断方法主要有皮内试验(ID)、间接血凝试验(IHA)、免疫酶染色试验(IEST)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫印渍技术(ELIB)等等。但是这些方法都费时、费力，样本不易保存及运输，每次收集的样本检测结果差异较大，不利于疾控部门及医疗机构进行批量操作以及临床单位的推广应用。而酶联免疫吸附试验(ELISA)在一定程度上解决了病原学方法和其他免疫诊断方法检测费时、费力、漏检率高等诸多缺点。在ELISA包被抗原选择上，若使用天然抗原提取物，可能存在天然抗原存批间差异大、纯化后杂质较多、有效抗原成份低等缺陷，容易造成试剂盒特异性较差、灵敏度较低、批间差异大等质量问题。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术通过蛋白质组学研究，筛选到一个潜在的诊断分子，并对其进行原核表达，基于该重组蛋白建立了一种新型的ELISA检测方法，用于动物及人的片形吸虫病的诊断。本专利技术是对片形吸虫组织蛋白酶抗原蛋白免疫原性的实际应用，涉及一种检测片形吸虫血清抗体的ELISA试剂盒及其制备方法和应用。本专利技术可以区分片形吸虫感染动物与非片形吸虫感染动物，该试剂盒以片形吸虫抗原特异性血清抗体为检测靶标，提高片形吸虫病检测方法的特异性。技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种CL7重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本
技术实现思路
还包括编码所述的CL7重组蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本
技术实现思路
还包括表达盒、重组载体或重组菌株，其含有所述的核酸或基因。本
技术实现思路
还包括所述的CL7重组蛋白、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或重组菌株在制备检测片形吸虫试剂盒方面的应用。本
技术实现思路
还包括一种用于片形吸虫诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括所述的CL7重组蛋白。其中，作为优选，所述试剂盒包括包被所述的CL7重组蛋白的酶标板和HRP标记酶标二抗以及其他相配套试剂。其中，作为优选，所述HRP标记酶标二抗为抗绵羊IgG二抗或绵羊抗牛IgG二抗或山羊抗人IgG。其中，作为优选，所述其他相配套试剂为样品稀释液、洗涤液和终止液。其中，作为优选，所述样品稀释液为的pH为7.4的PBS缓冲液其中，作为优选，所述洗涤液为浓缩洗涤液，优选为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。其中，作为优选，所述终止液为2M硫酸溶液。其中，作为优选，所述试剂盒还包括酶底物溶液显色液TMB(碧云天PO209)。其中，作为优选，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中，作为优选，所述阳性对照为人工感染片形吸虫绵羊或牛血清抗体阳性对照。其中，作为优选，所述阴性对照为人工未感染片形吸虫绵羊或牛血清抗体阴性对照。其中，作为优选，所述CL7重组蛋白的包被浓度为1～50μg/ml。本
技术实现思路
还包括提供一种所述的检测感染片形吸虫动物血清的ELISA试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：(1)直接取出试剂盒中制备的包被所述的CL7重组蛋白的酶标板；(2)加样：取包被了片形吸虫特异性重组抗原CL7的酶标板，在稀释板加入250μL样品稀释液，再加入1.25μL待测血清(1/200稀释)，检测孔直接加入相应的检测样本、绵羊或牛血清阳性和阴性对照样本100μL，每一个样本均做一个重复孔，在37℃下避光反应60min；(3)洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；(4)除空白对照孔外，每孔加与检测样品对应的稀释好的酶标的二抗100μL，振荡均匀，置37℃下避光反应60min，两点吸液，浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；(5)显色：每孔加显色液TMB100μL，置37℃下避光显色10min；(6)测定：每孔加终止液50μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长(630nm作参比波长)读数。优选地，所述读数后的结果判定为空白对照孔OD值＜0.1，绵羊阳性对照＞1.686(2cut-off值)，牛阳性对照孔＞1.504(2cut-off值)，绵羊阴性对照孔＜0.422(cut-off值/2)，牛阴性对照孔＜0.3761(cut-off值/2)；优选地，临界值(cut-off)为0.752(牛血清)0.843(羊血清)；样本OD值≥cut-off值时，判为片形吸虫抗体阳性；样本OD值＜cut-off值时，判为片形吸虫抗体阴性。本专利技术所述检测试剂盒可以用于所有的哺乳动物的片形吸虫的检测，所述的哺乳动物包括但不仅限于人、牛、羊等。有益效果：本专利技术采用的是酶联免疫诊断技术，包被在酶标板上的特异性片形吸虫重组抗原CL7可以特异性结合阳性血清中的抗片形吸虫抗体，加入的辣根过氧化物酶标记的血清相应的二抗与之结合，形成片形吸虫重组抗原-血清中的抗片形吸虫抗体-辣根过氧化物酶标记的二抗三者特异性的复合物，再加入显色剂TMB后，经TMB发生氧化还原反应产生特异波长的光波，经含450nm/630nm波长的酶标仪读数后即可进行定性判断。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1、本专利技术试剂盒酶标检测抗体通过HRP标记的抗体来进一步发挥信号放大效果增加反应的灵敏度，同时降低检测抗体的用量和成本；2、本专利技术试剂盒不受其他血清的干扰，交叉反应小，制备的重组抗原用于片形吸虫病的ELISA检测，敏感性要高于传统的虫卵检查，敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原，完全适合于片形吸虫病的现场筛查；3、本专利技术试剂盒可用于畜牧地区的流行病学调查和养殖场的疾病监测，具有广阔的市场前景和巨大的经济潜能和社会效益。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CL7重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CL7重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.编码权利要求1所示的CL7重组蛋白的核酸或基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


3.表达盒、重组载体或重组菌株，其含有权利要求2所述的核酸或基因。


4.权利要求1所述的CL7重组蛋白、权利要求2所述的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组菌株在制备检测片形吸虫试剂盒方面的应用。


5.一种用于片形吸虫诊断的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的CL7重组蛋白。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄思扬，龚静芝，潘明，范益敏，姚娜，吴云萍，祭天锴，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32