香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用，属于林业分子生物学技术领域，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.14所示，将其应用在香樟品种鉴定、古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用中，包括基因组DNA的提取、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及数据分析的步骤。本发明专利技术对18个古樟群体186个个体进行了遗传结构和遗传多样性研究，并根据香樟现有的遗传结构和遗传多样性格局，分析了可能形成的原因，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。SSR分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平。

Polymorphic primers for SSR molecular markers of Cinnamomum camphora nuclear genome and their application

【技术实现步骤摘要】
香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用
本专利技术属于林业分子生物学
，具体涉及香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物及其应用。
技术介绍
香樟(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)为亚热带常绿阔叶林代表树种，在我国长江以南地区广为分布。我国栽培利用香樟历史悠久，古樟资源丰富，蕴含着宝贵的基因资源，但其遗传变异水平及其亲缘地理关系鲜有报道。基于DNA分子标记的研究结果来看，其结论各异。姚小华利用9对RAPD引物对10个种源的82个家系香樟进行遗传多样性分析，共扩增出146条多态性条带，多态性比例为85.9％，遗传多样性较高。邢建宏分别利用ISSR和RAPD分析了福建南平林学院校内香樟的三种化学类型和三个近缘种的亲缘关系和遗传多样性，结果均表明福建香樟不同化学型间遗传多样性较高。潘晓华利用RAPD技术对7个群体共68个香樟个体进行遗传多样性和遗传结构分析，21对引物共扩增检测到168条条带，其中多样性条带为75条，比率为44.64％，表明香樟群体间遗传多样性水平较低。导致现有研究结论不一致的主要原因在于所选的群体数量有限。对遍布长江流域以南广大地区的香樟来说，要了解其真实的遗传多样性水平必须有足够的有代表性的群体样本。现有研究大多数只是针对局部地区，样本数最大的也只有41个种源164个个体。其次，香樟在我国具有较早的栽培历史，地区间引种栽培情频繁，其延续至今，针对群体遗传分析的样品起源有较大出入。此外，在研究手段上，早期使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平。SSR被称为第二代分子标记，又叫微卫星(microsatellite)，是基于PCR技术的发展起来的一种分子标记，是由几个核苷酸(一般为1到6个)为单位多次串联重复组成的特殊的DNA序列。这种序列几乎遍布所有真核生物的基因组中，含量丰富且随机均匀分布。微卫星由两侧保守的侧翼区和中间的核心区组成，核心区序列重复数的差异形成了微卫星的高度多态性，这种多态性的信息含量较为丰富。1986年Ali等人首次将微卫星技术用于人类DNA遗传分析，近些年来微卫星成为群体研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛应用于遗传连锁图谱构建，遗传多样性分析，品种鉴定等研究领域。
技术实现思路
针对现有技术所存在的使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平，本专利技术提供了香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物；并且提供了香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定、古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用；参试的18个香樟群体来自我国8个省份，相对广泛分布于全国的香樟，覆盖度广，能够更全面的揭示国内香樟的遗传多样性和遗传结构。为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案为：香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物，包括7对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：SSR20上游引物如SEQIDNO.1所示；SSR20下游引物如SEQIDNO.2所示；SSR23上游引物如SEQIDNO.3所示；SSR23下游引物如SEQIDNO.4所示；SSR35上游引物如SEQIDNO.5所示；SSR35下游引物如SEQIDNO.6所示；SSR52上游引物如SEQIDNO.7所示；SSR52下游引物如SEQIDNO.8所示；SSR55上游引物如SEQIDNO.9所示；SSR55下游引物如SEQIDNO.10所示；SSR86上游引物如SEQIDNO.11所示；SSR86下游引物如SEQIDNO.12所示；SSRJ6上游引物如SEQIDNO.13所示；SSRJ6下游引物如SEQIDNO.14所示。香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定中的应用。香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用。上述应用，包括以下步骤：1)提取不同品种香樟的基因组DNA；2)用权利要求1SEQIDNO.1-SEQIDNO.14所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；3)对步骤2)得到的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)数据分析核基因组SSR位点多态性，进行品种鉴定、古樟群体遗传结构和遗传多样性分析。进一步的，PCR扩增的体系为：10×buffer1μL；Mg2+25mM，0.3μL；dNTP2mM，0.5μL；上下游引物各10μM，0.4μL；DNA30ng/μL，0.6μL；rTaq酶5U/μL，0.05μL；ddH2O6.75μL；体系的总体积为10μL。进一步的，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。有益效果：与现有技术相比，本专利技术提供了多对核基因组SSR引物，对18个古樟群体186个个体进行了遗传结构和遗传多样性研究，并根据香樟现有的遗传结构和遗传多样性格局，分析了可能形成的原因，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。SSR分子标记重复性好，且为共显性标记，并且参试的18个香樟群体来自我国南方樟树自然分布最集中的8个省份，本专利技术更能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平。附图说明图1是引物SSR19和引物SSR20的部分群体扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图2是基于SSR标记的古樟群体UPGAM法聚类分析图；图3是基于SSR的古樟群体空间遗传结构分析图；图4是基于核基因组SSR标记的古樟群体结构分析结果图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术，但这些实施例并不用来限制本专利技术。实施例11)供试材料供试材料来源于香樟自然分布区的18个群体，分别为四川泸州、江西靖安、江西宁都、四川宜宾、贵州道真、广西桂林、江西恩江、江西龙岗、安徽安庆、江西乐安、江西瑞洪、江西萍乡、广东广州、江西南昌、贵州贵阳、贵州荔波、福建武夷山和江苏南京。选择胸径大于60cm的古樟树，每个个体采集5-10片新鲜叶片干冰运输，经液氮速冻于-80℃冰箱保存。具体采集群体位置、经纬度、样本数等见表1。表118个古樟群体采样信息来源样本量群体经度E°纬度N°四川泸州11SCLZ105.2628.58四川宜宾5SCYB104.2528.25江西靖安7JXJA115.1528.54江西宁都10JAND115.5126.26江西恩江6JXEJ<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物，其特征在于，包括7对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：/nSSR20上游引物如SEQ ID NO.1所示；/nSSR20下游引物如SEQ ID NO.2所示；/nSSR23上游引物如SEQ ID NO.3所示；/nSSR23下游引物如SEQ ID NO.4所示；/nSSR35上游引物如SEQ ID NO.5所示；/nSSR35下游引物如SEQ ID NO.6所示；/nSSR52上游引物如SEQ ID NO.7所示；/nSSR52下游引物如SEQ ID NO.8所示；/nSSR55上游引物如SEQ ID NO.9所示；/nSSR55下游引物如SEQ ID NO.10所示；/nSSR86上游引物如SEQ ID NO.11所示；/nSSR86下游引物如SEQ ID NO.12所示；/nSSRJ6上游引物如SEQ ID NO.13所示；/nSSRJ6下游引物如SEQ ID NO.14所示。/n

【技术特征摘要】
1.香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物，其特征在于，包括7对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：
SSR20上游引物如SEQIDNO.1所示；
SSR20下游引物如SEQIDNO.2所示；
SSR23上游引物如SEQIDNO.3所示；
SSR23下游引物如SEQIDNO.4所示；
SSR35上游引物如SEQIDNO.5所示；
SSR35下游引物如SEQIDNO.6所示；
SSR52上游引物如SEQIDNO.7所示；
SSR52下游引物如SEQIDNO.8所示；
SSR55上游引物如SEQIDNO.9所示；
SSR55下游引物如SEQIDNO.10所示；
SSR86上游引物如SEQIDNO.11所示；
SSR86下游引物如SEQIDNO.12所示；
SSRJ6上游引物如SEQIDNO.13所示；
SSRJ6下游引物如SEQIDNO.14所示。


2.权利要求1所述的香樟核基因组SSR分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定中的应用。


3.权利要求1所述的香樟核基因组SS...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟永达，杨茂霞，胥猛，余发新，郦芝汀，
申请(专利权)人：江西省科学院生物资源研究所，南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36