一种环状DNA的制备方法技术

本公开提供了一种环状DNA的制备方法，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰；(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物；(4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物；(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。所述制备方法简单易操作，且在方法中所使用的材料成本低，降低了制备环状DNA的成本。

A preparation method of circular DNA

【技术实现步骤摘要】
一种环状DNA的制备方法
本公开涉及核苷酸
，具体涉及一种环状DNA的制备方法。
技术介绍
滚环复制(环-介导的等温扩增，Loop-mediatedisothermalamplification-LAMP)是具有链置换能力的等温扩增酶利用环状DNA分子做模板，进行核酸扩增的方法。该方法与PCR(聚合酶链式反应)都能对微量的核酸模板进行序列特异的扩增，不同之处在于，滚环复制过程能够在恒定温度下完成扩增反应，因此不需要温控精确的PCR仪，是一种既简便又经济的核酸扩增方法，且不同序列的单链环状DNA分子通过滚环复制，能够生成不同长度的串联重复序列。天然的基因和蛋白中存在大量的随机重复序列，这些重复序列组成特异的模序，能够急剧增加候选基因的生物大分子的生理特异性和活性。这种模序广泛分布于启动子/增强子等核酸序列，促进反式作用因子对靶序列的识别，产生叠加和/或者协同效用。通过构建大的随机重复序列库，是研究体内或者体外研究结构-功能之间的关系的重要策略之一。通过制备单链环状DNA分子进行滚环复制，可以制备不同长度和重复次数的随机重复序列。目前常用的单链环状DNA模板主要来源是病毒的单链环状DNAM13mp18(7249bp)以及酶连反应产生的的单链环状DNA分子(sscDNA,singlestrandcircularDNA)，sscDNA分子长度一般为34-120bp，但是使用单链环状病毒DNAM13mp18，这种病毒培养的过程慢，成本高，从而导致M13mp18的价格较高，且单链M13mp18DNA分子量(Molecularweight)大，若底物浓度过高，会抑制滚环复制反应的进行。在现有的酶连反应产生单链环状DNA分子的制备方法中，多倚赖DNA(guideDNA)做引导分子，完成目标序列的连接，这种方法会导致终产物中残留微量引导DNA分子，使得后续DNA聚合酶利用其作引物进行滚环复制，从而对结果分析造成干扰。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种环状DNA的制备方法，以达到降低成本的目的。为实现上述目的，技术方案如下：一种环状DNA的制备方法，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰；(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物；(4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物；(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。所述步骤(3)中退火的反应条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h。所述步骤(3)中退火的反应体系为合成的单链DNA分子：引导RNA分子：退火缓冲液：去RNA酶水的体积比为1：2：1：7。所述退火缓冲液包括：100mMTris-HCl、10mMEDTA、和1MNaCl，所述Tris-HCl的PH值为7.5。所述步骤(4)连接反应的条件为：首先16℃反应16h，然后65℃反应20min。所述步骤(4)中连接反应的体系为连接缓冲液：退火产物：连接酶：H2O的体积比为3：1：2.5：30。所述连接酶为SplintR连接酶或T4DNA连接酶。所述步骤(5)中核酸外切酶为ExonucleaseI外切酶和T7Exonuclease外切酶的混合物。核酸外切酶消化的反应体系为连接产物：ExonucleaseI外切酶：T7Exonuclease外切酶的体积比为7：1：2。所述步骤(5)中核酸外切酶消化的条件为：25℃反应16h。本公开的有益效果是：提供了一种环状DNA的制备方法，所述制备方法简单易操作，且在方法中不需要实用单链环状病毒DNAM13mp18，其余材料成本低，从而降低了制备环状DNA的成本。同时本公开所述的环状DNA的制备方法突破了模板序列的限制，而且在制备过程中无需添加外源DNA，而是添加了根据需要成环的单链DNA分子末端所合成的RNA分子，减少了干扰，且还利用了核酸外切酶消化了未成环的线性核苷酸，进一步的减少了副产物的产生，大大增加了单链环状DNA的产率，而且本公开所述的环状DNA的制备方法所制备的单链环状DNA还可用于检测DNA聚合酶是否具备链置换能力。附图说明图1为实施例1中退火产物、连接产物和核酸外切酶消化产物的凝胶电泳图。图2为实施例2滚环复制产物的凝胶电泳图。图3为实施例3不同的延伸反应时间下产物的凝胶电泳图。图4为实施例4DNA聚合酶链置换能力检测图。具体实施方式以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。实施例1一种环状DNA的制备方法，具体操作步骤为：(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰，其中单链DNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.1：5’-pATTGGTCTACATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCCTACGGATTGC；(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子的两端互补配对，其中引导RNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.2：5’-UAGACCAAUGCAAUCCGUA-3’；(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物，其中退火反应的体系如表1所示，表1退火反应体系试剂体系DNA(100uM)1uLRNA(100uM)2ul10×buffer1uLRnase-freeH2O加至总体积10ul其中10x退火缓冲液包括：100mMTris-HCl(pH7.5)、10mMEDTA和1MNaCl，退火反应的条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1A泳道1所示；(4)利用SplintR连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物，其中连接反应的体系如表2所示，表2连接反应体系试剂体积10xSplintR连接酶缓冲液3退火产物(10μM)1Ligase(10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环状DNA的制备方法，其特征在于，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：/n(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰；/n(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；/n(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物；/n(4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接产物；/n(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；/n(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。/n

【技术特征摘要】
1.一种环状DNA的制备方法，其特征在于，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：
(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰；
(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；
(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物；
(4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接产物；
(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；
(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。


2.根据权利要求书1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中退火的反应条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h。


3.根据权利要求书1中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中退火的反应体系为合成的单链DNA分子：引导RNA分子：退火缓冲液：去RNA酶水的体积比为1：2：1：7。


4.根据权利要求书3中所述的环状DNA的制备方法，其特征在于，所述退火缓冲液包括：100mMTris-HCl、10mMEDTA、和1MN...

【专利技术属性】
技术研发人员：高亚平，田晖，何筠，邓素华，伊戈尔·伊万诺夫，
申请(专利权)人：深圳清华大学研究院，安序源生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44