一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法技术

本发明专利技术属于一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，具体步骤包括：（1）称取200 mg PCADK溶于2 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取20µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5µg/µL；量取60 mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；（2）在13500 rpm/min的均质条件下，将20µL的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌2 min，得到乳液；（3）以1500 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，‑20℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。本发明专利技术利用PCADK包载具有治疗作用的质粒，实现了基因的可控递送，提高了基因转染效率。

Preparation of pcadk composite microspheres containing apoptosis gene

【技术实现步骤摘要】
一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法
本专利技术属于药用材料
，具体涉及一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法。
技术介绍
随着科技的进步，从分子层面治疗疾病的方式——基因治疗，越来越受到科研人员的关注，其原理是将有治疗效果的核酸分子（DNA或siRNA等）导入靶细胞内，利用其特异选择性，调控基因表达，进而发挥治疗作用。基因治疗的关键是基因必须有效地靶向目标细胞才能高效的发挥作用，但游离的核酸分子存在诸多缺陷限制其广泛应用，包括体内稳定性差，易被快速清除或被核酸酶降解以及其负电性阻碍与细胞膜相互作用，不能有效地到达靶细胞，导致转染效率低。因此，基因治疗的首要挑战就是发展安全高效的基因载体来保护核酸分子，提高体内循环稳定性，促进核酸分子被靶标细胞摄取，实现高效转染，发挥基因治疗的作用。基因递送载体系统主要分为两类：病毒性载体和非病毒性载体。病毒性载体如逆转录病毒、慢病毒和腺病毒，已经逐步利用多种专门的分子学机制来克服细胞内屏障，实现高效的基因转染。然而由于病毒性载体具有一些固有缺点，包括安全性问题、非特异性、价格昂贵，限制了其广泛的应用。而非病毒性载体由于其低免疫原性、高包载能力以及能大规模生产的潜力，被广泛关注。相比较于病毒性载体，非病毒载体虽易被功能化，但难以有效地克服基因递送过程中的各种屏障，基因转染效率低。所以，怎样利用非病毒载体包载基因，实现基因的可控递送，提高基因转染效率是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的就在于提供一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，制备得到的PCADK复合微球实现了基因的可控递送，提高了基因转染效率。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：（1）称取100~400mgPCADK溶于1~4mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取10~50µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5µg/µL；量取40~100mL，浓度为1%PVA水溶液作为外水相备用；（2）在10000-15000rpm/min的均质条件下，将包含凋亡基因的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌1~5min，得到乳液；（3）以1000~5000rpm/min速率不断搅拌1%PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。进一步地，所述PCADK按如下方法制备得到：（1）称取1,4-环己烷二甲醇5~8g，搅拌溶解在60~100mL苯中形成苯溶液，升温至90~100℃；（2）将20~30mg对甲苯磺酸溶解在1~2mL乙酸乙酯中后加入到上述苯溶液中，升温至100~110℃，保持温度稳定4~8min，蒸除乙酸乙酯；（3）降温至90~100℃，加入5.0~8.0mL2,2-二甲氧基丙烷反应，后每隔1h补加2.5mL2,2-二甲氧基丙烷及适量的苯，使反应体系的溶液体积保持不变，直到反应结束；（4）然后在氮气保护条件下，搅拌反应24~72h，再升温至105℃，蒸除部分苯，降温至60℃，然后加入0.45mL三乙胺，搅拌0.5h，终止反应；冷却至室温，将反应液加入到400mL4℃预冷的正己烷中，搅拌析出淡黄色固体，离心干燥即得PCADK。这里采用4℃预冷的正己烷，主要是降低PCADK在正己烷中的溶解度，利于PCADK析出。进一步地，所述凋亡基因为BBC3、Bax或Noxa。具体地，用双酶切凋亡基因和质粒，使得它们具有相同的黏性末端，然后利用DNA连接酶将凋亡基因和质粒连接在一起形成包含凋亡基因的质粒溶液。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术利用可降解的非病毒载体PCADK依靠物理作用包载凋亡基因的质粒，实现了基因的可控递送，并利用PCADK的酸敏感性，实现在肿瘤组织周围的定点释放，提高了基因转染效率，从而提高了对肿瘤生长的抑制率。附图说明图1-制备得到的聚缩酮PCADK。图2-PCADK的紫外全波长扫描曲线。图3-PCADK的红外表征图谱。图4-PCADK的1HNMR图谱。图5-实施例1制备得到的BBC3@PCADK复合微球的SEM扫描电镜图。图6-PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球的Zeta电位表征图。图7-PCADK空白微球、实施例1~3制备得到复合微球的DLS表征图。图8-PCADK空白微球的细胞毒性检测实验结果。图9-实施例1制备得到的BBC3@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果。图10-实施例2制备得到的Bax@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果。图11-实施例3制备得到的Noxa@PCADK复合微球的细胞毒性检测实验结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。制备聚缩酮PCADK聚缩酮PCADK的合成路线为：具体制备方法如下：称取1,4-环己烷二甲醇6.3431g，搅拌溶解在78mL苯中，升温至92℃；再将21.4mg对甲苯磺酸溶解在1.5mL乙酸乙酯后加入到上述苯溶液中，升温至105℃，保持温度稳定5min，蒸除乙酸乙酯；然后降温至92℃，加入5.4mL2,2-二甲氧基丙烷反应，后每隔1h补加2.5mL2,2-二甲氧基丙烷及适量的苯，使反应体系的溶液体积保持不变；然后在氮气保护条件下，搅拌反应24~72h，再升温至105℃，蒸除部分溶剂，降温至60℃，然后加入0.45mL三乙胺，搅拌0.5h，终止反应；冷却至室温，将反应液加入到400mL4℃预冷的正己烷中，搅拌析出淡黄色固体，离心干燥即得PCADK，离心后得到的PCADK如图1所示。所得到的的PCADK的紫外全波长扫描曲线、红外表征图谱和1HNMR图谱分别如图2、图3和图4所示，由图2可知，PCADK在可见光以及红外光区域没有吸收峰，只有在200-400nm波长范围内存在紫外吸收；由图3可知，3440cm-1为-OH的伸缩振动峰，2800-3000cm-1和1450cm-1为亚甲基和甲基的碳氢伸缩振动峰以及亚甲基的变形振动峰，1044cm-1为缩酮键-C-O-C-的吸收峰；由图4可知，δ=3.19-3.28ppm为缩酮键氧原子相连的-CH2-对应的峰，δ=1.82ppm为环己烷上-CH-对应的峰，δ=0.93-1.58为环己烷上-CH2-对应的峰，δ=1.32为缩酮键碳原子连接的-CH3对应的峰。实施例1制备包载凋亡基因BBC3@PCADK复合微球（1）称取200mgPCADK溶于2mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取20µL包含基因BBC3的质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：/n（1）称取100~400 mg PCADK溶于1~4 mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取10~50 µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5 µg/µL；量取40~100 mL，浓度为1% PVA水溶液作为外水相备用；/n（2）在10000-15000 rpm/min的均质条件下，将包含凋亡基因的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌1~5 min，得到乳液；/n（3）以1000~5000 rpm/min速率不断搅拌1% PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20 ℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。/n

【技术特征摘要】
1.一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）称取100~400mgPCADK溶于1~4mL二氯甲烷得到PCADK二氯甲烷溶液，作为油相备用；提取10~50µL包含凋亡基因的质粒溶液作为内水相备用，其中质粒浓度为5µg/µL；量取40~100mL，浓度为1%PVA水溶液作为外水相备用；
（2）在10000-15000rpm/min的均质条件下，将包含凋亡基因的质粒溶液缓慢滴入PCADK二氯甲烷溶液的冰浴中，继续搅拌1~5min，得到乳液；
（3）以1000~5000rpm/min速率不断搅拌1%PVA水溶液，然后将步骤（2）得到的乳液滴入上述PVA水溶液，继续搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后离心、洗涤、真空冷冻干燥，-20℃保存，即得到所述包载凋亡基因的PCADK复合微球。


2.根据权利要求1所述的一种包载凋亡基因的PCADK复合微球的制备方法，其特征在于，所述PCADK按如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘义，王巧，鲁越，王云，雷宇，黄维，孟渂偲，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，
类型：发明
国别省市：四川;51