一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种制备樟子松针叶原生质体的方法，属于物细胞生物技术领域。所述方法包括（1）获得墇子松幼苗针叶，获得所述针叶叶条；（2）将所述叶条进行预处理；（3）将叶条放入酶解液中进行酶解；（4）将叶条从酶解液中取出，放入W5'溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5'溶液中；（5）将包含原生质体的W5'溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；（6）将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体。利用本发明专利技术，可获得较多数量并且状态良好、耐受性强的原生质体。

Preparation and application of a protoplast of Pinus sylvestris needles

【技术实现步骤摘要】
一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用
本专利技术属于植物细胞生物
，具体地，涉及一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用。
技术介绍
植物原生质体是指通过质壁分离能分开的由质膜包围的有活力的细胞团。虽因失去了细胞壁的保护而比较脆弱，但每个原生质体都含有该个体的全部遗传信息，在适宜的培养条件下，具有再生成与其亲本相似个体的全能性。此外，原生质体能够克服性细胞的不亲和障碍，进行远缘的体细胞杂交，可创造出有性杂交所不能得到的种间或属间杂种，并扩大遗传物质基础；而且，在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的，这为植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究提供了理想材料。原生质体还可摄取外源细胞器、病毒、核酸等各种大分子，可作为遗传转化的理想受体，进行分子育种、基因瞬时表达分析、基因互作研究等。植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶及少量蛋白质，通常采用酶解法制备原生质体。做为模式植物的拟南芥的原生质体分离步骤已十分成熟（YooSD,ChoYH,SheenJ.Arabidopsismesophyllprotoplasts:aversatilecellsystemfortransientgeneexpressionanalysis[J].NatProtoc,2007,2(7):1565-1572.）。此外，已经有多种被子植物实现了原生质体的优化，如非洲菊（宋爱华,张文斌,孙姝兰,等.非洲菊原生质体制备及瞬时转化系统的建立[J].植物学报，2017，52(4):511–519.），杨树（郭传敏.杨树原生质体分离及电融合技术体系的研究[D].南京林业大学,2007.）、橡胶树（(王凉洁.橡胶树叶肉细胞原生质体的制备及瞬时表达系统对植物免疫反应的检测[D].海南大学,2014.）、桑树（羿德磊,王海朋,崔为正,袁传忠,王洪利.桑树原生质体分离条件的优化试验[J].蚕业科学,2012,38(02):204-209）等，但是，裸子植物相对较少。在针叶树中，国内外对火炬松（PinustaedaL.）（唐巍,欧阳藩,郭仲琛.影响火炬松胚性悬浮细胞原生质体的胚胎发生的因素(英文)[J].Developmental&ReproductiveBiology,1997(02):56-63.），海岸松（GOMEZ-MALDONADOJ,CRESPILLOR,AVILAC,etal.EfficientPreparationofMaritimePine(Pinuspinaster)ProtoplastsSuitableforTransgene[J].PlantMolecularBiologyReporter,2001.）等研究基础较好的树种开发了原生质体制备体系，但这些体系分离效率低且分离后的原生质体状态差，难以进行后续实验，且重复性较差。樟子松（Pinussylvestrisvar.mongolica）为常绿乔木，产于我国黑龙江大兴安岭海拔400~900m山地及海拉尔以西、以南一带砂丘地区。樟子松林木具有生长较快、适应性强、抗风沙、耐干旱、耐瘠薄、抗严寒的特点，是东北大兴安岭山区及西部砂丘地区的重要造林树种，也是重要用材、生态和景观树种，具有重要的经济、生态和社会价值。而且，有研究表明：樟子松乙醇提取物具有较强的抗氧化能力，可作为天然的抗氧化剂（张力凡，薛煜，王岩等.樟子松乙醇提取物体外抗氧化活性研究[J].植物研究2019，39(3)：458—465.），对于预防老年痴呆症、关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化、帕金森氏病等疾病有重要作用。但是，对其生物学深层次的研究较少，且暂无关于其原生质体分离的研究。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种制备墇子松针叶原生质体的方法。本专利技术提供的一种制备墇子松针叶原生质体的方法包括以下步骤：（1）获得墇子松幼苗针叶，切除下胚轴，沿生长方向纵切，获得所述针叶叶条；（2）将步骤（1）获得的所述叶条进行预处理；（3）将叶条放入酶解液中进行酶解；（4）将叶条从酶解液中取出，放入W5'溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5'溶液中；（5）将步骤（4）获得的包含原生质体的W5'溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；（6）将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体，其中，所述W5'溶液是指包含BSA的W5溶液。在本专利技术的一些实施方案中，所述获得墇子松幼苗针叶，具体包括以下步骤：选取墇子松种子，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照16/8h黑暗的气候箱中进行萌发；2周后，选取生长状态良好墇子松幼苗，摘取针叶。在本专利技术的一些实施方案中，所述预处理是指将所述叶条置于甘露醇溶液中。经过预处理，可释放叶片中存在的次生代谢产物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述甘露醇溶液的浓度为0.2～1.0M，例如0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M。在本专利技术的一些优选实施方案中，所述甘露醇溶液的浓度为0.4～0.7M，例如0.4M、0.425M、0.45M、0.475M、0.5M、0.525M、0.55M，0.575M、0.6M、0.625M、0.65M、0.675M、0.7M。在本专利技术的一些更优选实施方案中，所述甘露醇溶液的浓度为0.5M。在本专利技术的一些实施方案中，所述酶解液的10mL体系配制方法如下：（a）依次加入纤维素酶R100.15g，果胶酶Y230.04g，纤维素酶RS0.1g，半纤维素酶0.1g，1M甘露醇6mL，2MKCl0.1mL，2MMES1mL；（b）将步骤（a）获得的溶液于55℃水浴10min，冷却至室温；（c）向步骤（b）获得的冷却后的溶液中依次加入1MRbCl20.1mL，10%BSA0.1mL，ddH2O2.7mL，即得到所述酶解液。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述2MMES在使用前于70℃水浴5min。在本专利技术的一些实施方案中，所述酶解的条件是：室温、黑暗静置8～12h。在本专利技术的一些实施方案中，所述W5'溶液中含有BSA的质量分数为1%～20%，例如为0%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%。在本专利技术的一些优选实施方案中，所述W5'溶液中含有BSA的质量分数为2%。在本专利技术的一些优选实施方案中，在步骤（5）和步骤（6）之前进一步包括向包含原生质体的W5'溶液已被转移的叶条上再次加入W5'溶液，颠倒清洗叶条，将清洗叶条后的W5'溶液进行步骤（6）的过滤，重复多次，例如1-10次，再例如5-7次。如此，经过多次洗涤叶条，提高原生质体产量。在本专利技术的又一些优选实施方案中，步骤（6）重复多次，例如1次、2次、3次、4次、5次。如此，经多次洗涤并富集原生质体，可获得较多状态良好的樟子松原生质体。本专利技术的有益效果相对于现有技术，本专利技术具有以下有效效果：1.高效制备樟子松原生质体不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备樟子松针叶原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n获得墇子松幼苗针叶，切除下胚轴，沿生长方向纵切，获得所述针叶叶条；/n将步骤（1）获得的所述叶条进行预处理；/n将叶条放入酶解液中进行酶解；/n将叶条从酶解液中取出，放入W5'溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5'溶液中；/n将步骤（4）获得的包含原生质体的W5'溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；/n将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体，/n其中，所述W5'溶液是指包含BSA的W5溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备樟子松针叶原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得墇子松幼苗针叶，切除下胚轴，沿生长方向纵切，获得所述针叶叶条；
将步骤（1）获得的所述叶条进行预处理；
将叶条放入酶解液中进行酶解；
将叶条从酶解液中取出，放入W5'溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5'溶液中；
将步骤（4）获得的包含原生质体的W5'溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；
将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体，
其中，所述W5'溶液是指包含BSA的W5溶液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理是指将所述叶条置于甘露醇溶液中。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甘露醇溶液的浓度为0.2～1.0M。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘露醇溶液的浓度为0.5M。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液的的10mL体系配制方法如下：
依次加入纤维素酶R100.15g...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，朱茜雅，韩方旭，钮世辉，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11