一种检测细胞内极性的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向线粒体检测细胞内极性的荧光探针：

A fluorescent probe for the detection of intracellular polarity and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞内极性的荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种靶向线粒体检测细胞内极性变化的荧光探针及其应用。
技术介绍
极性作为化学和化工领域中一个极其重要的化学参数，自从问世便引起广大学者的重视，目前关于极性参数在化学反应中的影响己有深入的研究。随着学者们对极性的不断了解，发现在生物微环境中的各项生命活动同样受到极性变化的影响。在细胞的代谢过程中总是伴随着内环境极性的变化，细胞极性是细胞分裂、定向生长和运动等过程所必需的，使细胞间的形态和功能定向分化。如果细胞内极性发生异常变化，可能出现了某种生理或病理现象，因此，检测细胞内极性的变化对于监测不同的细胞状态至关重要，可以帮助我们深入了解生理过程和病理过程。细胞生物学面临的许多关键问题涉及化学物质的位置和浓度，从分子信号到代谢物再到外源性毒素。荧光分子成像是生物学和生命科学领域不可缺少的工具，荧光探针对特定的分析物非常敏感，改变了人们对生物系统的认识。荧光探针以其灵敏度髙、选择性强、响应速度快、操作简单等优点，成为监测细胞内微环境的重要工具。线粒体作为真核细胞内重要的细胞器，在维持人体生理的众多功能方面发挥着重要作用。线粒体的基本作用是通过氧化磷酸化和脂质氧化产生能量。线粒体除了作为动力工厂这一众所周知的功能外，在某种意义上也被认为是控制细胞某些方面的神经中枢。线粒体极性是细胞器的一个重要特征，对细胞活动有很大的影响。线粒体极性也会影响细胞生命活动的诸多过程，例如蛋白质的运输和相互作用，酶的活性和稳定性，细胞功能的维持和细胞的稳态等。因此，准确监测线粒体极性变化具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对目前缺少在光致细胞死亡过程中生理变化研究的问题，本专利技术提供一种靶向线粒体快速检测细胞内极性的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测生物细胞内极性的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种靶向线粒体检测细胞内极性的荧光探针，化学名称为（4-（（9-（二乙氨基）-5-氧代-5H-苯并[a]苯恶嗪-2-基）氧基）丁基）三苯基膦，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）化合物a与化合物b在氮气保护下于DMF中加热反应，分离提纯到化合物c：；（2）在氮气保护下，化合物c与化合物d在碳酸钾和DMF溶液中反应，分离提纯得化合物e：；（3）化合物e与化合物f在氮气保护下于乙腈中加热反应，分离、提纯得化合物g，即为荧光探针：。步骤（1）中，所述化合物a与化合物b的物质的量比为1:1；步骤（1）中，所述反应温度为140℃，反应时间为5h；步骤（1）中，所述分离提纯步骤为：将反应后的体系，萃取分离合并有机相，用石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:1比例的展开剂除去前面的杂质，后用二氯甲烷：甲醇（V/V）=100:1比例的展开剂常压下得到红色生成物。步骤（2）中，所述化合物c与化合物d的物质的量比为1:5；步骤（2）中，反应时间为12h；步骤（2）中，所述分离提纯步骤为：将反应后的体系加入二氯甲烷与水，收集有机相，减压蒸馏除去溶剂，然后柱层析；所述柱层析洗脱液为二氯甲烷：甲醇（V/V）=130:1。步骤（3）中，所述化合物e与化合物f的物质的量比为1:1；步骤（3）中，所述反应温度为90℃，反应时间为12h；步骤（3）中，所述分离提纯步骤为：将反应后的体系减压蒸馏除去溶剂，然后柱层析；所述柱层析洗脱液为二氯甲烷：甲醇（V/V）=20:1。一种上述荧光探针在检测细胞内极性的应用。一种上述荧光探针在制备检测细胞内极性的试剂中的应用。本专利技术的机理如下：本专利技术的荧光探针是通过连接一个极化敏感的尼罗红和一个线粒体靶向的三苯基膦单位来构建的。该探针在荧光团中引入三苯基膦等正电荷基团，由于线粒体膜具有高度负电荷，亲脂性阳离子三苯基膦在进入细胞后优先在线粒体中富集，靶向线粒体；对极性敏感的尼罗红，对环境极性高度敏感。因此，该探针可以检测生物膜的极性变化，实验证明了这一点。用探针观察了胆固醇治疗引起的线粒体极性下降。特别是由于其高吸收率和低量子率，在激光照射下会产生大量的热量，从而降低细胞的生存能力。该探针成功地揭示了线粒体极性在光诱导细胞死亡过程中被下调。我们认为，在检测线粒体极性和PTT过程探针可以作为一个强大的工具。本专利技术具有以下优点：本专利技术首次制备了极性敏感型PTT增敏剂，用于研究光致细胞死亡过程中细胞内极性的变化。该探针以活细胞中的线粒体为靶点。激光照射一段时间后，经探针预孵育的Hepg2活细胞的细胞活力显著下降。探针成功揭示了光诱导细胞死亡过程中线粒体极性的下调。附图说明图1是荧光探针NRTP的1HNMR图谱；图2是荧光探针NRTP的13CNMR图谱；图3是荧光探针NRTP在不同极性巨噬细胞中的成像测试，λex=561nm；图4是在活细胞中荧光探针NRTP与线粒体深红探针的共定位成像应用，其中，a–c为实验活的细胞图像Hepg2细胞孵育5μMNRTP，d-f为5μMNRTP和200nMMTDR共同孵育30分钟。(a)明场图像;(b,d)λex=561nm，红色通道;(e)λex=647nm，深红通道;(c、f)合并图像。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成（1）6-羟基尼罗红（c）的合成在50mL梨形烧瓶中加入反应物a（400mg,2mmol），反应物b(350mg，2.1mmol）用5mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，溶液为棕黑色，在N2保护下，140℃下反应5h，通过TLC检测，产生具有红色荧光的新物质，萃取分离合并有机相。用石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:1比例的展开剂除去前面的杂质，后用二氯甲烷：甲醇（V/V）=100:1比例的展开剂常压下得到红色生成物（c）。（2）2-（4-溴丁氧基）-9-（二乙氨基）-5H-苯并[a]苯恶嗪-5-酮（e）的合成在50mL梨形烧瓶中加入化合物c(100mg，0.3mmol)，化合物d(326mg，1.5mmol）和碳酸钾（208mg，1.5mmol）加入5mLDMF溶解，溶液为鲜红色，在N2保护下室温反应12h。通过TLC检测，生成极性略小的一个红色荧光点。加入二氯甲烷与水萃取产物收集有机相，减压蒸馏除去溶剂。柱层析分离极性为二氯甲烷：甲醇（V/V）=130:1展开剂常压下得到红色生成物（e），产率50%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.24(d,J=8.7Hz,1H),8.06(d,J=2.6Hz,1H),7.62(d,J=9.1Hz,1H),7.18(dd,J=8.7,2.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向线粒体检测细胞内极性的荧光探针，其化学结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向线粒体检测细胞内极性的荧光探针，其化学结构式为：

。


2.一种如权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）化合物a与化合物b在氮气保护下于DMF中加热反应，分离提纯到化合物c：

；
（2）在氮气保护下，化合物c与化合物d在碳酸钾和DMF溶液中反应，分离提纯得化合物e：

；
（3）化合物e与化合物f在氮气保护下于乙腈中加热反应，分离、提纯得化合物g，即为荧光探针：

。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述化合物a与化合物b的物质的量比为1:1；步骤（2）中，所述化合物c与化合物d的物质的量比为1:5；步骤（3）中，所述化合物e与化合物f的物质的量比为1:1。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述反应温度为140℃，反应时间为5h；步骤（2）中，反应时间为12h；步骤（3）中，所述反...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，郭丁一，刘闯，田明刚，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37