用于核酸靶向富集的方法和试剂盒技术

公开了由生物样品富集靶核酸序列的试剂盒和方法。该方法包括制备分别靶向每个靶核酸序列中的成对物段的两条反向平行链的第一RNA探针组和第二RNA探针组，并将它们与生物样品接触。第一RNA探针组和第二RNA探针组中的每个RNA探针可以通过化学合成或通过体外或体内转录产生，并且能被生物素标记，从而使得能够通过用链霉亲和素标记的磁珠捕获靶核酸序列，或者将其工程化为微流体通道以促进捕获。该方法能应用于捕获双链核酸序列或具有成对物段的单链核酸序列，并且该核酸序列可以包括DNA、RNA或DNA‑RNA杂合分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸靶向富集的方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求于2017年4月6日提交的美国临时申请No.62/482,189和2018年2月4日提交的PCT申请No.PCT/US2018/016778的优先权，其内容通过全文引用并入本文。参考以电子形式提交的序列表在此提交的电子提交序列表的内容，文件名为Library_SEQ_Capture_ST25.txt，大小为190883字节，以及创建日期为2018年2月26日，均通过全文引用并入本文。
本专利技术大体上涉及诊断和预后领域，具体地涉及生物标志物
，更具体地涉及用于遗传和基因组分析的核酸测定，并且更具体地涉及核酸测定中的用于核酸序列靶向富集的方法和试剂盒。
技术介绍
基因组测序，尤其是最近的下一代测序(NGS)技术，已经成为可以对疾病或个体背后的所有遗传信息进行全局分析的一种工具。例如，NGS已在临床上广泛用于疾病诊断，用于个性化治疗和疾病监测的伴随诊断。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种用于由生物样品富集至少一个靶核酸序列的方法。该方法包括以下两个步骤：(1)制备至少一对RNA探针组，每对包括第一RNA探针组和第二RNA探针组，该第一RNA探针组和第二RNA探针组被配置成分别靶向至少一个靶核酸序列中每一个的成对物段(duplexsegment)的两条反向平行链，其中，第一RNA探针组和第二RNA探针组的任一组中的每个RNA探针都用固定部分标记，该固定部分被配置为使得能够固定在固体载体上；以及(2)通过分别使至少一对RNA探针组中的每对中的第一RNA探针组和第二RNA探针组两者分别与至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链杂交，并通过标记在第一RNA探针组和第二RNA探针组的任一个组的每个RNA探针上的固定部分固定至固体载体上，由生物样品捕获至少一个靶核酸序列的每条链。本文中，至少一个靶核酸序列中的每一个能是双链核酸分子(诸如双链DNA分子、双链RNA分子，或DNA-RNA杂合分子)，或具有发卡结构的单链核酸分子(即DNA或RNA)。这样，借助于至少一对RNA探针组(其中每对中的第一RNA探针组和第二RNA探针组分别靶向每个靶核酸序列中成对物段的两个反向平行链)，能由生物样品捕获或富集至少一个靶核酸序列。典型的实例是，生物样品中至少一个靶核酸序列的每一个可以是双链DNA分子，其具有反向平行延伸以形成双链体的正链和负链。通过至少一对RNA探针组(其中每对中的第一RNA探针组和第二RNA探针组分别靶向每个靶核酸序列中的两条反向平行链(即，正链和负链))，能由生物样品捕获或富集每个靶DNA分子的每条链(包括正链和负链)。本文中，根据该方法的一些实施方案，至少一对RNA探针组中的一对或更多对可以通过化学合成来制备。这样，制备至少一对RNA探针组的步骤(1)能包括：进行化学合成反应，从而获得至少一对RNA探针组中的一对或更多对。在化学合成反应期间，至少一对RNA探针组中的一对或更多对中的每一对中的每个RNA探针能用固定部分标记。在本文中，固定部分共价附着于固体载体上(即，每个RNA探针直接在与固定部分偶联的固体载体上合成)。或者，可以在化学合成反应后，用固定部分标记至少一对RNA探针组中的一对或更多对的每一对中的每个RNA探针，并因此制备至少一对RNA探针组的步骤(1)进一步包括：进行标记反应，使得至少一对RNA探针组中的一对或更多对的每一对中的每个RNA探针都被固定部分标记。根据该方法的一些其他实施方案，至少一对RNA探针组中的一对或更多对通过转录制备。这样，制备至少一对RNA探针组的步骤(1)能包括：进行转录反应，从而获得至少一对RNA探针组中的一对或更多对。本文中，进行转录反应从而获得至少一对RNA探针对中的一对或更多对的子步骤能包括：进行转录反应，使得在每个转录反应过程中至少一对RNA探针组中的一对或更多对的任一对中的每个RNA探针被固定部分标记。根据一些实施方案，每个转录反应在用固定部分标记的NTP的存在下进行，其中所述NTP包含ATP、UTP、GTP和CTP中的至少一种。本文中，用固定部分标记的NTP能优选包含经生物素标记的UTP，并且在每个转录反应中存在的所有UTP中，经生物素标记的UTP可具有2％-100％的相对摩尔百分比。或者，在每个转录反应后，在至少一对RNA探针对中的一对或更多对中的任一对中的每个RNA探针都用固定部分标记。这样，进行转录反应从而获得至少一对RNA探针组中的一对或更多对的子步骤能包括：进行转录反应；以及进行标记。根据一些实施方案，进行转录反应的上述子步骤能包括：提供了多个DNA载体，其包含至少一对DNA载体，每对包含第一DNA载体和第二DNA载体，其被配置为分别使得第一RNA分子和第二RNA分子能够转录，所述第一RNA分子和第二RNA分子能够分别靶向至少一个靶核酸序列的一个或更多个中的每一个的成对物段的两条反向平行的链；以及对多个DNA载体进行转录反应。本文中，多个DNA载体中的每一个能包括选自T3启动子、T7启动子或SP6启动子之一的启动子。转录反应中的至少一个可以在体外，或体内进行。根据该方法的一些实施方案，对多个DNA载体进行转录反应的子步骤包括：合并多个DNA载体以获得至少两个DNA载体库，使得每对DNA载体中的第一DNA载体和第二DNA载体不在同一DNA载体库中；以及分别对至少两个DNA载体库的每一个进行转录反应以获得与至少两个DNA载体库的每一个相对应的RNA分子。在分别对至少两个DNA载体库的每一个进行转录反应的子步骤之后以及在进行标记的子步骤之前，该方法能进一步包括：对RNA分子进行片段化反应，所述RNA分子对应于至少两个DNA载体库的每一个。根据该方法的一些其他实施方案，不是在转录之前合并DNA载体，而是对多个DNA载体进行转录反应的子步骤包括：对多个DNA载体中的每一个进行转录反应，从而获得与其对应的RNA分子。这样，在对多个DNA载体中的每一个进行转录反应的子步骤之后以及在进行标记的子步骤之前，该方法能进一步包括：合并与多个DNA载体中的每一个相对应的RNA分子以获得至少两个RNA库，使得RNA分子对不在同一RNA库中，所述RNA分子对分别靶向至少一个靶核酸序列中的一个或更多个中的任一个的成对物段的两条反向平行链；以及分别对至少两个RNA库的每一个进行片段化反应。或者，在对多个DNA载体中的每一个进行转录反应的子步骤之后以及在进行标记的子步骤之前，该方法能进一步包括：分别对与多个DNA载体的每一个相对应的RNA分子进行片段化反应，以获得与多个DNA载体的每一个相对应的经片段化的RNA分子；以及合并与多个DNA载体中每一个相对应的经片段化RNA分子，使得一对经片段化的RNA分子不在同一RNA探针组中，所述一对经片段化的RNA分子分别靶向至少一个靶核酸序列中的一个或更多个中的任一个的成对物段的两本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于由生物样品富集至少一个靶核酸序列的方法，包括：/n制备至少一对RNA探针组，每对包括第一RNA探针组和第二RNA探针组，所述第一RNA探针组和第二RNA探针组被配置为分别靶向所述至少一个靶核酸序列中每一个的成对物段的两条反向平行链，其中，所述第一RNA探针组和第二RNA探针组的任一组中的每个RNA探针用固定部分标记，所述固定部分被配置为使得能够固定在固体载体上；以及/n通过使至少一对RNA探针组中的每对中的所述第一RNA探针组和所述第二RNA探针组两者分别与所述至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链杂交，并通过标记在所述第一RNA探针组和第二RNA探针组的任一组中的每个RNA探针上的所述固定部分来固定至所述固体载体上，由所述生物样品捕获至少一个靶核酸序列的每条链。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170406 US 62/482,189;20180204 US PCT/US2018/01671.一种用于由生物样品富集至少一个靶核酸序列的方法，包括：
制备至少一对RNA探针组，每对包括第一RNA探针组和第二RNA探针组，所述第一RNA探针组和第二RNA探针组被配置为分别靶向所述至少一个靶核酸序列中每一个的成对物段的两条反向平行链，其中，所述第一RNA探针组和第二RNA探针组的任一组中的每个RNA探针用固定部分标记，所述固定部分被配置为使得能够固定在固体载体上；以及
通过使至少一对RNA探针组中的每对中的所述第一RNA探针组和所述第二RNA探针组两者分别与所述至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链杂交，并通过标记在所述第一RNA探针组和第二RNA探针组的任一组中的每个RNA探针上的所述固定部分来固定至所述固体载体上，由所述生物样品捕获至少一个靶核酸序列的每条链。


2.权利要求1所述的方法，其中，所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对是通过化学合成制备的，并且所述制备至少一对RNA探针组包括：
进行化学合成反应，从而获得所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对。


3.权利要求2所述的方法，其中，在所述化学合成反应期间，所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对中的每一对中的每个RNA探针用所述固定部分标记。


4.权利要求3所述的方法，其中，在所述化学合成反应期间，所述固定部分共价附着到所述固体载体上。


5.权利要求2所述的方法，其中，在所述化学合成反应后，所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对中的每一对中的每个RNA探针用所述固定部分标记，并且所述制备至少一对RNA探针组进一步包括：
进行标记反应，使得所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对中的每一对中的每个RNA探针用所述固定部分标记。


6.权利要求1所述的方法，其中，所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对是通过转录制备的，并且所述制备至少一对RNA探针组包括：
进行转录反应从而获得所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对。


7.权利要求6所述的方法，其中，所述进行转录反应，从而获得所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对包括：
进行转录反应，使得在每个所述转录反应期间，所述至少一对RNA探针对中的一对或更多对中的任一对中的每个RNA探针用所述固定部分标记。


8.权利要求7所述的方法，其中，每个所述转录反应在标记有所述固定部分的NTP的存在下进行，其中所述NTP包括ATP、UTP、GTP和CTP中的至少一种。


9.权利要求8所述的方法，其中，所述标记有所述固定部分的NTP包括经生物素标记的UTP。


10.权利要求9所述的方法，其中，在每个所述转录反应中存在的所有UTP中，所述生物素标记的UTP的相对摩尔百分比为2％-100％。


11.权利要求6所述的方法，其中，在每个所述转录反应后，所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对中的任一对中的每个RNA探针用所述固定部分标记，并且所述进行转录反应从而获得所述至少一对RNA探针组的一对或更多对包括：
进行所述转录反应；以及
进行标记。


12.权利要求6所述的方法，其中，所述进行转录反应包括：
提供多个DNA载体，所述多个DNA载体包括至少一对DNA载体，每对包括第一DNA载体和第二DNA载体，所述第一DNA载体和第二DNA载体被配置为分别使得第一RNA分子和第二RNA分子能够转录，所述第一RNA分子和第二RNA分子分别靶向所述至少一个靶核酸序列的一个或更多个中的每一个的成对物段的两条反向平行链；以及
对所述多个DNA载体进行所述转录反应。


13.权利要求12所述的方法，其中，所述多个DNA载体中的每一个包括选自T3启动子、T7启动子或SP6启动子之一的启动子。


14.权利要求12所述的方法，其中，在对所述多个DNA载体进行转录反应中，至少一个所述转录反应在体外进行。


15.权利要求12所述的方法，其中，在对所述多个DNA载体进行转录反应中，至少一个所述转录反应在体内进行。


16.权利要求12所述的方法，其中，对所述多个DNA载体进行转录反应包括：
合并所述多个DNA载体以获得至少两个DNA载体库，使得所述每对DNA载体中的所述第一DNA载体和第二DNA载体不在同一DNA载体库中；以及
分别对所述至少两个DNA载体库的每一个进行转录反应以获得与所述至少两个DNA载体库的每一个相对应的RNA分子。


17.权利要求16所述的方法，在所述分别对所述至少两个DNA载体库的每一个进行转录反应之后并且在所述进行标记之前，进一步包括：
对与至少两个DNA载体库中的每一个相对应的RNA分子进行片段化反应。


18.权利要求12所述的方法，其中，对所述多个DNA载体进行转录反应包括：
对所述多个DNA载体中的每一个进行转录反应，从而获得与其相对应的RNA分子。


19.权利要求11所述的方法，在对所述多个DNA载体的每一个进行转录反应之后并且在所述进行标记之前，进一步包括：
合并与所述多个DNA载体中的每一个相对应的所述RNA分子以获得至少两个RNA库，使得RNA分子对不在同一RNA库中，所述RNA分子对分别靶向所述至少一个靶核酸序列中的一个或更多个中的任一个的成对物段的两条反向平行链；以及
分别对所述至少两个RNA库的每一个进行片段化反应。


20.权利要求11所述的方法，在对所述多个DNA载体的每一个进行转录反应之后并且在所述进行标记之前，进一步包括：
分别对与所述多个DNA载体的每一个相对应的RNA分子进行片段化反应，以获得与所述多个DNA载体的每一个相对应的经片段化的RNA分子；以及
合并与所述多个DNA载体中每一个相对应的经片段化RNA分子，使得经片段化的RNA分子对不在同一RNA探针组中，所述经片段化的RNA分子对分别靶向所述至少一个靶核酸序列中的一个或更多个中的任一个的成对物段的两条反向平行链。


21.权利要求11所述的方法，其中，所述进行标记包括：
进行连接反应，使得经固定部分标记的核苷酸与所述至少一对RNA探针组中的每一对中每个RNA探针的一个末端或中间连接。


22.权利要求21所述的方法，其中，在每个所述连接反应中，将经生物素标记的核苷酸的5’磷酸末端连接到所述至少一对RNA探针组中的每一对中每个RNA探针的3’羟基末端。


23.权利要求22所述的方法，其中，每个所述连接反应通过RNA连接酶进行。


24.权利要求23所述的方法，其中，所述RNA连接酶包括T4RNA连接酶或CircLigaseRNA连接酶的至少一种。


25.权利要求1所述的方法，其中，所述制备至少一对RNA探针组包括：
在所述固体载体上进行直接转录，从而获得所述至少一对RNA探针组中的一对或更多对。


26.权利要求1所述的方法，其中，由所述生物样品捕获所述至少一个靶核酸序列的每条链包括：
使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触；以及
将所述至少一个靶核酸序列固定在所述固体载体上。


27.权利要求26所述的方法，其中，所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组中的任一组中的每个RNA探针长度为约100-150nt，其中：
使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触在约62-70℃的温度下进行，并进行约6-24小时。


28.权利要求27所述的方法，其中，使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触在约67.5℃的温度下进行。


29.权利要求26所述的方法，其中，所述至少一对RNA探针组的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组分别靶向所述至少一个靶核酸序列的每一个的成对物段的不同部分，并且使所述至少一对RNA探针组的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触包括：
在单次杂交反应中，使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述至少一个靶核酸序列接触。


30.权利要求26所述的方法，其中，所述至少一对RNA探针组的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组分别靶向所述至少一个靶核酸序列的每一个的成对物段的基本上相同的部分，并且使所述至少一对RNA探针组的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触包括至少以下一轮：
在第一杂交反应中，使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组中的一组与所述至少一个靶核酸序列接触；以及
在第二杂交反应中，使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组中的另一组与所述至少一个靶核酸序列接触。


31.权利要求26所述的方法，其中，所述至少一对RNA探针组的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组分别靶向所述至少一个靶核酸序列的每一个的成对物段的基本上相同的部分，并且使所述至少一对RNA探针组的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触包括至少以下一轮：
分别在第三杂交反应和第四杂交反应中，使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组与所述至少一个靶核酸序列单独地接触；以及
将所述第三杂交反应和所述第四杂交反应结合，从而使得能够进行第五杂交反应。


32.权利要求26所述的方法，其中，所述生物样品中的所述至少一个靶核酸序列中的一个或更多个各自在含有至少一个非靶序列的多核苷酸中，其中，所述方法在使所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组均与所述生物样品中的至少一个靶核酸序列接触之前，进一步包括：
使所述至少一个封闭寡核苷酸与所述至少一个靶核酸序列接触，使得所述至少一个封闭寡核苷酸分别与所述多核苷酸中至少一个非靶序列的每一个的至少一条链杂交，从而使其封闭。


33.权利要求32所述的方法，其中，所述多核苷酸中的所述至少一个非靶序列包括在所述至少一个靶核酸序列的一个或更多个的每一个侧翼的第一衔接子序列和第二衔接子序列，其中：
所述至少一个封闭寡核苷酸被配置为分别封闭所述多核苷酸中的所述第一衔接子序列的一条链和所述第二衔接子序列的一条链。


34.权利要求33所述的方法，其中，所述至少一个封闭寡核苷酸被配置为分别封闭所述多核苷酸中的所述第一衔接子序列的两条反向平行链和所述第二衔接子序列的两条反向平行链。


35.权利要求33所述的方法，其中，所述至少一个封闭寡核苷酸包括第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组，每一组包括一个或更多个封闭寡核苷酸，所述封闭寡核苷酸被配置为分别封闭所述多核苷酸中所述第一衔接子序列和第二衔接子之一的两条反向平行链，其中，使所述至少一个封闭寡核苷酸与所述至少一个靶核酸序列接触包括：
使所述第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组中的一组与所述至少一个靶核酸序列接触；以及
使所述第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组中的另一组与所述至少一个靶核酸序列接触。


36.权利要求1所述的方法，其中，由所述生物样品捕获所述至少一个靶核酸序列的每条链包括：
通过标记在所述至少一对RNA探针组中的每一对中的所述第一RNA探针组和第二RNA探针组中的任一组的每一个RNA探针上的固定部分，使所述至少一对RNA探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磬，张明，
申请(专利权)人：王磬，
类型：发明
国别省市：天津;12