基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术“基于电场诱导释放检测技术直接结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒”，涉及电化学基因检测技术，所述试剂盒包括检测CP4‑EPSPS序列的组合1和检测Lectin序列的组合2，可以快速高效地检测待测大豆材料是否为转基因材料。

Transgenic detection method and kit based on field induced release detection technology and target gene fragment

【技术实现步骤摘要】
基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测技术，特别是基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒
技术介绍
转基因作物,又被称为生物技术作物，是运用DNA重组技术将外源基因整合到受体植物基因组中，从而改变其基因组成和基因表达的植物及其后代。目前，获批准的几十种转基因作物中，转基因大豆的种植面积最大，占据全球转基因作物种植面积的56％。转基因大豆主要是指抗草甘膦大豆，是Monsanto公司研发成功的抗草甘膦大豆，其商品名为RoundupReadyTM。草甘膦(Glyphosate,英文又名Roundup)是一种施于叶片、广谱性、非选择性的有机磷类除草剂，其作用的机理是特异抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)的活性，使其氨基酸合成受阻而死亡。由于所有植物都需要EPSPS来催化氨基酸的合成，所以在使用后，所有植物都会被杀死。抗草甘膦大豆基因工程的主要方法，就是采用修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，即促进EPSPS过量表达或用编码点突变的靶蛋白基因。Monsanto公司研究人员将CaMV35S启动子控制下的矮牵牛的EPsPs基因转入到大豆基因组中，获得了莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)表达量增加20-40倍的转基因大豆。这种大豆对除草剂草甘膦具有高度耐受性，在大田中施用草甘膦不会影响大豆产量。目前已知的转基因大豆中的外源基因片段有Lectin,CP4-EPSPS,PAT,GAT4601,Cry1Ac,FMV35S-P,CaMV35S-P,NOS-3',CaMV35S-T。在我国，大豆及豆制品是传统食品，消耗量巨大。近些年来，我国从传统的大豆出口国转变成为世界头号大豆进口国，而在进口的大豆中，上述转基因大豆占三分之二以上。而转基因大豆的毒性和安全隐患问题一直备受争议。为保护消费者对转基因食品的知情权和选择权，建立相应的完善的转基因大豆检测技术显得尤其重要。目前,转基因大豆检测技术发展迅速。根据检测样品及靶标的不同，已经衍生出很多相应的检测方法和手段。常用的检测转基因大豆的方法有以下几种，各有特点。酶联免疫分析技术(ELISA)、试纸条法，其检测的准确性依赖检测物中靶标蛋白质的活性及结构并受杂质的影响。由于豆制品中的蛋白质会随着加工程度的不同而产生不同程度的变性，特别是一些经过高温高压深加工的豆制品，因此，在实际检测中难度较大，实际检测效率、准确性较差。普通PCR技术，是能够快速、简便的扩增转基因大豆特异性片段CP4-EPSPS，并且具有高度的专一性和灵敏性。但检测过程需要较长时间，并不适用于快速鉴定。并且PCR扩增产物易污染实验区，易引起后期实验的假阳性等实验结果。此外，对工作人员技术和实验室要求高，工作人员需进行专门培训。荧光PCR检测技术：目前有文献报道检测限可到0.01％，与普通PCR相比，实时荧光PCR技术在特异性、灵敏度和准确性方面均显示了巨大优势。且弥补了传统PCR技术交叉污染及假阳性的不足。但仍存在一些问题，荧光定量PCR技术对样本制备要求较高，且易受到DNA降解、复杂基质干扰等因素影响。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，柳毅等以CP4一EPSPS外源基因为检测的目的片段，进行LAMP扩增，检测已知转基因大豆和市售大豆，检出限为0.01％。LAMP技术灵敏度高、特异性好、耗时短且对仪器要求不高，但引物设计较为复杂，对扩增产物处理不当容易造成污染，影响结果。直接测序法：易受到DNA降解、复杂基质干扰等因素影响，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。基因芯片技术：是将合成好的报告基因、启动子、终止子的特异性核苷酸片断以预先设定的排列方式固定在固相支持介质表面，形成高密度的阵列，待测产品的DNA与探针进行杂交，由特殊的装置检出信号，并由计算机进行分析综合，判断待测样品是否为转基因产品。但它制作芯片技术复杂，需要专门的仪器设备，所需的成本太高。另外，昂贵的检测仪器和复杂的样品制备限制了基因芯片技术作为常规的检测手段。杂交检测方法：主要是Southern杂交和Northern杂交。Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术，可以确定外源DNA的位置和拷贝数。Northern杂交是将材料RNA与探针杂交的技术，用于检测基因在转录水平上的表达。Southern杂交和Northern杂交的基本过程都是将待检测的核酸段转移到一个特定部分的固相的支持物上，并进一步的结合到固相支持物上，然后使用核酸探针事前标记过的，检测将要检测的核酸。这种方法快速方便和易于操作，同时可以对多个样品进行测试。但在测试样品之前，不能对样品进行扩增放大，使检测灵敏度较低。另外，检测所需时间过长，无法进行现场检验或初筛。综上，基于聚合酶链式反应(PCR)的各种衍生体系，如PCR反应的各种变形，如实时荧光PCR、LAMP，或者基于测序反应的NGS，以及基于分子杂交原理的基因芯片等。以上方法各有优缺点，都能在某些方面满足食品安全转基因的检测要求，但是由于以上方法均需要通过链式酶扩增反应来扩增目标基因片段的数量，因此都无法避免基因扩增造成的气溶胶污染，所以对实验环境以及实验人员的要求很高，标准实验室造价高昂，整体运行成本高，也无法进行现场检测，特别是用在进出口海关检验时，大大影响大豆及豆制品的通关速度。
技术实现思路
为了满足在不同场合简便地检测大豆及豆制品的转基因情况，本专利技术提供了一种简单、易用、快速、可靠的技术，概括如下：基于EFIRM技术检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包括以下探针组合：检测CP4-EPSPS序列的组合1，由第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3，和第1检测探针：5-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT-3组成，所述CP4-EPSPS序列为：5-GACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAAC检测Lectin序列的组合2，由第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3，和第2检测探针：5-GTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG-3组成，所述Lectin序列为：CCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAG。优选地，所述检测探针3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物；所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素。优选地，还包括催化酶，所述催化酶为带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素。优选地，还包括对应所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于EFIRM技术检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包括以下探针组合：检测CP4-EPSPS序列的组合1，由/n第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3，和/n第1检测探针：5-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT-3组成，/n所述CP4-EPSPS序列为：5-GACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAAC检测Lectin序列的组合2，由/n第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3，和/n第2检测探针：5-GTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG-3组成，/n所述Lectin序列为：CCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAG。/n

【技术特征摘要】
1.基于EFIRM技术检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包括以下探针组合：检测CP4-EPSPS序列的组合1，由
第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3，和
第1检测探针：5-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT-3组成，
所述CP4-EPSPS序列为：5-GACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAAC检测Lectin序列的组合2，由
第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3，和
第2检测探针：5-GTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG-3组成，
所述Lectin序列为：CCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAG。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物；所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括催化酶，所述催化酶为带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对应所述催化酶的底物；
当所述催化酶为辣根过氧化物酶时，所述底物是TMB、ABTS和OPD中的任一种；
当所述催化酶为碱性磷酸酶时，所述底物是BCIP和NBT的组合物、对硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。


5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述捕获探针固定至检测孔板上的反应孔中的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；
所述导电聚合物为吡咯、苯胺和噻吩中的任一种；
所述离子化合物为氯化钠或氯化钾。


6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括清洗液，所述清洗液包括洗液A和洗液B，所述洗液A是含SDS的SSC缓冲液，所述洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。


7.一种基于EFIRM技术检测转基因大豆的检测孔板，其特征在于，所述检测孔板的反应孔底部设置有工作电极并配置为可施加电压以形成电场；
所述检测孔板的反应孔内分配并固定有以下核苷酸序列所示的捕获探针：
第...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玮，莫亚勤，张晨光，
申请(专利权)人：广州易活生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44