一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用，涉及医药技术领域。其包括如下步骤：(1)构建转基因斑马鱼；(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模；在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中，先构建表达载体，再将表达载体与Tol2 mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；表达载体包括pdx1基因启动子，编码荧光蛋白的基因和nsfb基因；其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。本发明专利技术利用pdx1启动子构建胰腺组织特异表达荧光蛋白和硝基还原酶的转基因品系，对该品系用含有硝基基团的化合物诱导可特异杀死胰腺组织细胞，从而模拟II型糖尿病。

Construction and application of a zebrafish model with type \u2161 diabetes mellitus

【技术实现步骤摘要】
一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用
本专利技术涉及医药
，具体而言，涉及一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用。
技术介绍
以胰岛β细胞受损为特征的糖尿病(Diabetesmellitus,DM)是危害人类健康的慢性、终身性代谢疾病。糖尿病发生是由于体内胰岛素信号通路受损或是胰岛素靶点的敏感性降低，导致糖代谢异常从而引起血糖升高，糖尿病伴有心血管病变等并发症，如糖尿病肾病，神经慢性损害和视网膜病，随着糖尿病患病率不断提高，糖尿病及其相关的器官病变成为困扰人们生活的主要健康问题。胰岛素水平较低或者血糖浓度较高是糖尿病患者最明显的指征，胰岛素起着降低血糖的作用，胰岛β细胞是唯一能合成并释放胰岛素的细胞，所以胰腺的发育状况对血糖调控至关重要。为方便研究糖尿病发病机制及降血糖药物开发，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用以解决上述技术问题。本专利技术是这样实现的：一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法，其包括如下步骤：(1)构建转基因斑马鱼；(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模；在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中，先构建表达载体，再将表达载体与Tol2mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；表达载体包括pdx1基因启动子，编码荧光蛋白的基因和nsfb基因；其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。本专利技术先构建转基因斑马鱼品系，再用药物对构建好的转基因斑马鱼进行造模，最终获得Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型。在构建转基因斑马鱼的过程中，先进行表达载体的构建。表达载体中包括pdx1基因启动子，pdx1基因编码胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreasandduodenumhomeobox1,pdx1)也称胰岛素启动因子1，pdx1基因是一种与糖尿病相关的基因，特别是与Ⅱ型糖尿病易感性增加有关，pdx1大多表达于胰岛内分泌胰岛素的β细胞和分泌生长抑素的δ细胞中，具有调节胰腺发育和分化的功能，其表达水平对维持正常血糖内稳态至关重要。老鼠中pdx1基因纯合突变致死，杂合突变表现为高血糖症；斑马鱼中敲除pdx1导致外分泌和内分泌腺细胞明显减少，敲除pdx1将引发胰腺发育缺陷，胰岛素分泌缺失从而导致糖尿病症状(WangX,2018；KellerMP，2018；YoshidaT,2010；GuG,2002；BrissovaM,2002；LinglingYE,2017；AhlgrenU,1998)。本专利技术在载体中插入pdx1基因启动子可以保证构建的转基因斑马鱼可以在胰腺特异表达硝基还原酶和红色荧光蛋白，保证加入甲硝唑底物处理时可特异杀死胰腺组织从而诱导二型糖尿病。nsfb基因编码的蛋白叫NTR，nsfb基因即硝基还原酶B(NitroreductaseB，nfsB)基因，其源自于大肠埃希菌(EscherichiacoliB)，硝基还原酶B基因编码的硝基还原酶(Nitroreductase，NTR)蛋白能与含有硝基基团的化合物如甲硝唑(Metronidazole，MTZ)结合，把甲硝唑还原成甲胺唑，而甲胺唑对细胞具有毒性。该物质能有效结合于DNA双链，抑制细胞核酸的合成，干扰细胞的生长，最终导致细胞死亡。本专利技术表达载体中设置nsfB基因片段，从而保证转基因品系能正常表达NTR蛋白，后续在甲硝唑的诱导下可有效、特异地杀死胰腺组织细胞。其他硝基咪唑类化合物也能够和硝基还原酶发生化学反应，优选为MTZ。进一步地，表达载体还包括编码荧光蛋白的基因，编码荧光蛋白的基因能表达荧光蛋白，当药物诱导时，特异地杀死胰腺组织细胞，荧光减弱，并引起血糖增高、胰岛素分泌紊乱等糖尿病症状从而模拟斑马鱼Ⅱ型糖尿病。利用该疾病模型，可广泛用于降血糖药物的筛选及开发应用，具有重要的意义。Tol2_mRNA用于提高对外源表达载体插入基因组的转座效率。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述pdx1基因启动子序列如SEQIDNO.6所示，nsfb基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；nsfb基因编码的NTR蛋白序列如SEQIDNO.8所示；编码荧光蛋白的基因为mCherry基因，编码橙色荧光蛋白的基因或编码黄色荧光蛋白的基因中的任意一种；优选的，编码荧光蛋白的基因为mCherry基因，mCherry基因编码的蛋白序列如SEQIDNO.7所示；mCherry基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。编码荧光蛋白的基因可以根据需要进行调整，优选为mCherry报告基因，mCherry报告基因能表达红色荧光蛋白，当药物诱导时，特异地杀死胰腺组织细胞，红色荧光减弱，并引起血糖增高、胰岛素分泌紊乱等糖尿病症状从而模拟斑马鱼Ⅱ型糖尿病。利用该疾病模型，可广泛用于降血糖药物的筛选及开发应用，具有重要的意义。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述表达载体的构建方法包括如下步骤：先构建pSTEos-pdx1中间载体并扩增mCherry-NTR插入片段，再将pSTEos-pdx1中间载体和mCherry-NTR插入片段进行双酶切，回收后连接构建得到所述表达载体Tol2-pdx1-mCherry-NTR。pSTEos及mCherry-NTR模板质粒均由孟安明实验室惠赠。mCherry-NTR插入片段可采用扩增或酶切pST-mylz2-mCherry-NTR质粒的方式获得。pST-mylz2-mCherry-NTR质粒由孟安明实验室惠赠。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述将pSTEos-pdx1中间载体和mCherry-NTR片段进行双酶切所采用的酶为XbaI和BamHI限制性内切酶。采用双酶切对pSTEos-pdx1中间载体进行酶切，获得两端带有酶切位点的pST-pdx1中间载体，采用双酶切对mCherry-NTR片段进行双酶切，再通过胶回收并将片段和载体进行连接获得最终的表达载体Tol2-pdx1-mCherry-NTR。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述表达载体的构建方法还包括构建pSTEos-pdx1中间载体，构建pSTEos-pdx1中间载体包括如下步骤：以斑马鱼基因组为模板，采用第一引物和第二引物扩增pdx1启动子片段，再对扩增获得的pdx1启动子片段和pSTEos载体进行双酶切，酶切回收后，连接获得pSTEos-pdx1中间载体；优选的，第一引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，第二引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；优选的，对扩增获得的pdx1启动子片段和pSTEos载体进行双酶切所采用的酶为BglII和BamHI限制性内切酶。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述药物为甲硝唑，甲硝唑的作用浓度为8-10mM；优选的，甲硝唑的作用浓度为8mM。当甲硝唑的作用浓度为8mM时，红色荧光减弱明显，转基因斑马鱼生存状况良好。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述斑马鱼胚胎在单细胞时期本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：/n(1)构建转基因斑马鱼；/n(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模；/n在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中，先构建表达载体，再将所述表达载体与Tol2mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；所述表达载体包括pdx1基因启动子，编码荧光蛋白的基因和nsfb基因；/n其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)构建转基因斑马鱼；
(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模；
在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中，先构建表达载体，再将所述表达载体与Tol2mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；所述表达载体包括pdx1基因启动子，编码荧光蛋白的基因和nsfb基因；
其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pdx1基因启动子序列如SEQIDNO.6所示，所述nsfb基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述nsfb基因编码的NTR蛋白序列如SEQIDNO.8所示；所述编码荧光蛋白的基因为mCherry基因，编码橙色荧光蛋白的基因或编码黄色荧光蛋白的基因中的任意一种；
优选的，所述编码荧光蛋白的基因为mCherry基因，所述mCherry基因编码的蛋白序列如SEQIDNO.7所示；所述mCherry基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：先构建pSTEos-pdx1中间载体并扩增mCherry-NTR插入片段，再将pSTEos-pdx1中间载体和mCherry-NTR插入片段进行双酶切，回收后连接构建得到所述表达载体Tol2-pdx1-mCherry-NTR。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将pSTEos-pdx1中间载体和mCherry-...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛钰，彭伟，许璟瑾，雷妙玉，潘裕添，
申请(专利权)人：闽南师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35