用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物技术

本公开内容涉及基因组工程领域，特别是细胞的基因组的靶向修饰。

Delivery method and composition for nuclease mediated genomic engineering transformation

【技术实现步骤摘要】
用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物相关申请的交叉引用本申请主张2013年10月17日申请的美国临时申请No.61/892,348和2014年8月5日申请的美国临时申请No.62/033,424的权益，所述申请的公开内容以其全文引用的方式并入本文。
本公开内容涉及基因组工程领域，特别是细胞的基因组的靶向修饰。专利技术背景已描述用于基因组DNA的靶向切割的各种方法和组合物。可使用这些靶向切割事件，例如，引起靶向突变，引起细胞DNA序列的靶向缺失，及促使在预定染色体基因座靶向重组。参见，例如，美国专利No.8,586,526；8,329,986；8,399,218；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960及美国申请No.14/278,903，所述专利申请的公开内容针对所有目的以其全文引用的方式并入本文。这些方法通常涉及使用工程改造的切割系统以引起双链断裂(DSB)或靶DNA序列缺口，因此，通过产生错误的过程诸如非同源末端连接(NHEJ)修复断裂或使用修复模板(同源导向的修复或HDR)修复可导致基因敲除或受关注的序列插入(靶向整合)。可通过使用特定核酸酶诸如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，使用以工程改造的crRNA/tracrRNA(‘单导向RNA’)导引特定切割的CRISPR/Cas系统和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如，从高度好热菌得到，称为‘TtAgo’,(Swarts等人(2014)Nature507(7491):258-261)，进行切割。使用一种上述核酸酶系统的靶向切割可采用HDR或NHEJ介导的过程中任何一种过程用于将核酸插入到特定靶位置。然而，将核酸酶系统和供体同时递送到细胞可能是问题所在。例如，通过转导质体进入到细胞中来递送供体或核酸酶可能对受体细胞，尤其对为初级细胞且不如来自细胞系的细胞强健的细胞有毒。CD34+干细胞或祖细胞是特征为其自我更新和/或分化为淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)和髓系(例如单核细胞、红血球、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞)能力的异质性细胞组。其异质性源自CD34+干细胞群体中存在多个常反映特定群的多能性(不论定向的谱系)的子群的事实。例如，为CD38-的CD34+细胞是较为原始的未成熟的CD34+祖细胞(也称为长期造血祖细胞)，而那些为CD34+CD38+的细胞(短期造血祖细胞)是定向的谱系(参见Stella等人(1995)Hematologica80:367-387)。当这一群体接着进一步以分化途径发展时，CD34标记物失去。CD34+干细胞在临床细胞疗法中具有巨大的潜力。然而，部分地归因於其异质性，可能难以在细胞上进行基因操作，诸如基因敲除、转基因插入等。具体来说，这些细胞通过常规的递送载体转导是不充分的，最原始的干细胞对修饰敏感，在引起的DNADSB后，HDR受到限制，及在延长时间的标准培养条件中HSC维持不足。另外，其它受关注的细胞(仅举非限制性实例来说，心肌细胞、中型棘突神经元、初级肝细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞和肌细胞)转导以进行基因组编辑可能不如其它细胞成功。因此，仍需要用于对CD34+细胞和其它受关注的毒性较小但更有效的细胞基因组工程改造的组合物和方法。专利技术概要本专利技术描述适用于基因疗法和基因组工程改造中的组合物和方法。具体来说，所述的方法和组合物涉及将核酸引入到细胞诸如初级细胞包括造血干细胞/祖细胞(HSC/PC)和T细胞中。此外，本专利技术的方法和组合物适用于递送包含受关注的供体DNA的AAV颗粒到这些细胞。在一些方面，本专利技术包括出于基因组工程改造的目的而递送至少一种核酸酶到细胞(例如，HSC/PC)。在一些实施方案中，核酸酶呈肽递送，而在其它实施方案中，核酸酶呈编码核酸酶的核酸递送。在一些实施方案中，使用不只一种核酸酶。在一些优选的实施方案中，编码核酸酶的核酸为mRNA，及在一些情况中，mRNA经过保护。核酸酶可包括锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)或CRISPR/Cas或TtAgo核酸酶系统或其组合。在一个优选的实施方案中，通过电穿孔递送编码核酸酶的核酸。一方面，本文提供一种将一个或多个转基因整合到分离的细胞的基因组中的方法，所述方法包括按顺序将转基因和至少一种核酸酶引入到细胞中以使核酸酶介导转基因的靶向整合。因此，在某些方面，提供一种将一个或多个转基因整合到分离的细胞的基因组中的方法，所述方法包括：将(a)包含一个或多个转基因的供体载体和(b)至少一种核酸酶引入到细胞中，其中所述至少一种核酸酶切割细胞的基因组以使所述一个或多个转基因整合到细胞的基因组中，及进一步地，其中(i)如果供体载体先于所述至少一种核酸酶之前被引入到细胞中，则在引入供体载体后的48小时内引入所述至少一种核酸酶到细胞中；及(ii)如果所述至少一种核酸酶先于供体载体被引入，则在引入所述至少一种核酸酶后的4小时内引入所述供体载体到细胞中。在某些实施方案中，所述方法可以包括(a)将包含一个或多个转基因的供体载体引入到细胞中；(b)培养所述细胞48小时以下(例如，几秒到48小时或其间的任何时间)；及(c)将至少一种核酸酶引入到所述细胞中，其中所述至少一种核酸酶切割所述细胞的基因组以使所述一个或多个转基因被整合到所述细胞的所述基因组中。或者，所述方法可以包括：(a)将至少一种核酸酶引入到细胞中；(b)培养所述细胞24小时以下(例如，几秒到24小时或其间的任何时间)；及(c)将包含一个或多个转基因的供体载体引入到所述细胞中，其中所述至少一种核酸酶切割所述细胞的基因组以使所述一个或多个转基因被整合到所述细胞的所述基因组中。可以重复所述方法步骤以将额外的转基因整合到相同和/或不同的基因座中。在某些实施方案中，将所述细胞培养(步骤(b))24小时以下(例如，几秒到24小时或其间的任何时间)。在其它的实施方案中，例如，当核酸酶在引入供体载体之前被引入时，将所述细胞培养4小时以下。可以使用任何细胞，例如，造血干细胞(例如，CD34+细胞)或T细胞(例如，CD4+或CD8+细胞)。供体载体可以呈病毒或非病毒载体例如AAV载体(例如，AAV6或AAV6嵌合载体(诸如AAV2/6)等)引入。核酸酶(例如，ZFN、TALEN、TtAgo和/或CRISPR/Cas)还可以使用病毒或非病毒载体例如呈mRNA形式引入。在某些实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种切割内源AAVS1基因的核酸酶，所述核酸酶包含DNA结合域和切割域，所述核酸酶包含：/n(i)第一和第二锌指核酸酶，所述第一锌指核酸酶包含6个锌指DNA结合域，各个锌指DNA结合域包含识别螺旋区，所述锌指DNA结合域的所述识别螺旋区排列为如下所示F1至F6：/nF1:RSDHLSR(SEQ ID NO:13)/nF2:TSGHLSR(SEQ ID NO:14)/nF3:YNWHLQR(SEQ ID NO:15)/nF4:RSDHLTT(SEQ ID NO:16)/nF5:HNYARDC(SEQ ID NO:17)，和/nF6:QNSTRIG(SEQ ID NO:18)；且/n所述第二锌指核酸酶包含6个锌指DNA结合域，各个锌指DNA结合域包含识别螺旋区，所述锌指DNA结合域的所述识别螺旋区排列为如下所述F1至F6：/nF1:DRSNLSR(SEQ ID NO:19)/nF2:LKQHLTR(SEQ ID NO:20)/nF3:TSGNLTR(SEQ ID NO:21)/nF4:RRDWRRD(SEQ ID NO:22)/nF5:QSSHLTR(SEQ ID NO:23)，和/nF6:RLDNRTA(SEQ ID NO:24)；或者/n(ii)结合SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中所示靶位点的单导向RNA(sgRNA)DNA结合域。/n...

【技术特征摘要】
20131017 US 61/892,348;20140805 US 62/033,4241.一种切割内源AAVS1基因的核酸酶，所述核酸酶包含DNA结合域和切割域，所述核酸酶包含：
(i)第一和第二锌指核酸酶，所述第一锌指核酸酶包含6个锌指DNA结合域，各个锌指DNA结合域包含识别螺旋区，所述锌指DNA结合域的所述识别螺旋区排列为如下所示F1至F6：
F1:RSDHLSR(SEQIDNO:13)
F2:TSGHLSR(SEQIDNO:14)
F3:YNWHLQR(SEQIDNO:15)
F4:RSDHLTT(SEQIDNO:16)
F5:HNYARDC(SEQIDNO:17)，和
F6:QNSTRIG(SEQIDNO:18)；且
所述第二锌指核酸酶包含6个锌指DNA结合域，各个锌指DNA结合域包含识别螺旋区，所述锌指DNA结合域的所述识别螺旋区排列为如下所述F1至F6：
F1:DRSNLSR(SEQIDNO:19)
F2:LKQHLTR(SEQIDNO:20)
F3:TSGNLTR(SEQIDNO:21)
F4:RRDWRRD(SEQIDNO:22)
F5:QSSHLTR(SEQIDNO:23)，和
F6:RLDNRTA(SEQIDNO:24)；或者
(ii)结合SEQIDNO:27和SEQIDNO:28中所示靶位点的单导向RNA(sgRNA)DNA结合域。


2.如权利要求1所述的核酸酶，其中所述切割域来自核酸内切酶。


3.如权利要求1所述的核酸酶，其中所述切割域来自Cas蛋白和/或IIS型核酸内切酶。


4.一种组合物，包含：
一种或多种如权利要求1至3中任一项所述的核酸酶；和
包含外源序列的AAV载体，其中，所述外源序列在所述一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·C·霍尔姆斯，汪建斌，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US