茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法，所述茶白星病菌经鉴定为痂囊腔菌，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019555。本发明专利技术提供了一株来自病叶新的痂囊腔菌(Elsinoe camellia sinesis)菌株Cs52，并被鉴定为茶白星病的致病菌。为该病的发生规律及生物防治的研发奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法。
技术介绍
茶白星病(Teawhitescabdisease)是高海拔茶园最严重的真菌病害之一，随着山区茶园的进一步发展，茶白星病的发生与为害更加严重。当茶树受到茶白星病菌侵染后，在叶片、茎秆、花苞均可出现密集的褐色小点或灰白色圆形斑，减产10％-50％以上，甚至片叶无收。感病芽叶制成的干茶叶底布满小斑、汤色浑暗，尤其味苦异常。生产上通常采用多菌灵等化学农药对该病进行防控，因发病期常为多雨季节，防效不佳，已日益发展成茶产业发展的技术瓶颈。加速茶白星病病原的致病机理、病害流行规律的研究，研发抗病品种等生态防控措施的需求十分迫切。然而，有关该病的研究却面临着一个十分基础性的问题——病原菌的分离鉴定尚有存疑。因此需要加速茶白星病病原的分离鉴定、再开展进一步病害流行规律的研究，明确茶白星病的致病菌的基本前提，并为抗茶白星病品种选育等生态防控措施提供科技支撑。
技术实现思路
基于此，针对上述
技术介绍
中技术问题，提供一种茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法。一种茶白星病菌，经鉴定为ElsinoecamelliasinesisCs52，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019555。在一些实施方式中，包括4段核苷酸序列，4段所述核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。本专利技术提供了一种所述的茶白星病菌单孢的分离方法，包括如下步骤：S1、切取病叶上病健交界处的病组织；S2、将病组织进行灭菌、清洗和晾干处理；S3、将S2步骤处理的组织浸渍在无菌载玻片上，并滴加1滴灭菌水，为使其保持湿润，将其保存在保湿室中，20～24℃下保存5小时，将小片提起，镜检，用毛细管吸引分生孢子的水滴，水滴在PDA上流动，分布在直径为9cm的表面皿全面上。待菌落生长形成孢子，通过琼胶平板表面单孢子挑取法进行单孢分离获得茶白星病菌单孢。在一些实施方式中，在S2步骤中，灭菌处理采用3％次氯酸钠。在一些实施方式中，所述PDA配方包括如下成分：200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂粉和蒸馏水定容至1L。本专利技术还提供了一种所述的茶白星病菌的鉴定方法，包括如下步骤：1)提取待测样品的总DNA；2)对所述总DNA进行PCR扩增；3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；4)回收目的片段，并将其克隆至载体上，通过菌液PCR筛选阳性克隆体；5)对所述阳性克隆体进行测序。在一些实施方式中，所述PCR扩增体系为:rTaq酶0.25μL，dNTPs0.4μL，DNA模板1μL，上下游引物各2μL，ddH2O定容至50μL。在一些实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一株来自病叶新的痂囊腔菌(Elsinoecamelliasinesis)菌株Cs52，并被鉴定为茶白星病的致病菌。为该病的发生规律及生物防治的研发奠定了基础。附图说明图1为茶白星病菌的田间症状表型的示意图；图2为茶白星病菌的菌落生长示意图；图3为T1和T2接种菌的形态学示意图；图4为T1的系统发育树图；图5为T2的系统发育树图；图6为T1和T2病菌的致病性测定的示意图。具体实施方式在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。在本专利技术的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。一种茶白星病菌，经鉴定为Elsinoecamelliasinesis，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019555。在一些实施方式中，包括4段核苷酸序列，4段所述核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。为了有助于进一步理解本专利技术，现结合优选实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明。实施例1：茶白星病菌的单孢分离1、一种茶白星病菌的单孢分离方法，包括如下步骤：S1、取采集的病叶，无菌水洗净，从病健交界处切取病组织2mm×2mm小块；S2、将病组织小块浸渍在无菌载玻片上，并滴加1滴灭菌水，为使其保持湿润，将其保存在保湿室中，20～24℃下保存5小时，将小片提起，镜检，用毛细管吸引分生孢子的水滴。；S3、将水滴在PDA上流动，分布在直径为9cm的表面皿全面上，置于培养箱中24℃黑暗培养6d，待菌落长出形成孢子，应用琼胶平板表面单孢子挑取法进行单孢分离。2、茶白星病菌的形态学观察染色观察：单孢分离的菌株，以PDA平板培养基在25℃恒温箱中培养至稳定期，记录菌落形态特点，并在光学或电子显微镜下观察分生孢子的形态特点。将发病斑块浸泡在98％无水乙醇中煮沸至叶色透明，置于玻片上，滴加一滴染液(石碳酸20ml，乳酸20ml，甘油40ml，蒸馏水20ml，棉兰50mg)，覆上盖玻片，轻压使标本平铺5min后镜检。电镜观察：单孢分离菌株，蘸取少许孢子，采用固定、脱水、置换、干燥、制样、喷金镀膜后在PhilipsXL-30型扫描电子显微镜下观察病菌孢子形态。3、茶白星病菌的形态特征茶白星病发生在海拔400m以上茶园的嫩芽、嫩叶、叶柄、嫩茎及花苞上，并以嫩叶上发生最多。茶白星病初期呈针头状褐色点，光照可见其边缘有黄色晕圈，病斑中央凹陷而其周围隆起，环绕初期斑点向外扩展，病叶斑点数达数十个，病斑直径不超过2mm，并相互融合形成大的不规则斑点，致使叶片扭曲变形或畸形，参见图1中a和b。嫩茎和花苞上也有病斑，但病斑数目较少，常为散生，参见图1中c和d。对来自不同茶园的358份茶白星病叶片病原菌进行分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茶白星病菌，经鉴定为痂囊腔菌(Elsinoe camellia sinesis)，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019555。/n

【技术特征摘要】
1.一种茶白星病菌，经鉴定为痂囊腔菌(Elsinoecamelliasinesis)，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019555。


2.根据权利要求1所述的茶白星病菌，其特征在于，包括4段核苷酸序列，4段所述核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。


3.如权利要求1或2所述的茶白星病菌单孢的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、切取病叶上病健交界处的病组织；
S2、将病组织进行灭菌、清洗和晾干处理；
S3、将S2步骤处理的组织浸渍在无菌载玻片上，并滴加1滴灭菌水，20～24℃下保存5小时，镜检，用毛细管吸引分生孢子的水滴，水滴在PDA上流动，分布在直径为9cm的表面皿全面上；待菌落生长形成孢子，通过琼胶平板表面单孢子挑取法进行单孢分离获得茶白星病菌纯化单孢。


4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，在S2步骤中，灭菌处理采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：周凌云，李维，刘红艳，向芬，银霞，曾泽萱，
申请(专利权)人：湖南省茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43