一种高产窄分布果胶寡糖的黑曲霉和果胶酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种产窄分布果胶寡糖的黑曲霉及其应用，所述黑曲霉为黑曲霉(Aspergillus niger)1805，其保藏号为：CGMCC No.15670。该菌所产生的果胶酶能使商业化果胶产生聚合度5‑8为主的果胶寡糖产物。

Aspergillus niger and pectinase with high yield and narrow distribution of pectin oligosaccharides and their application

【技术实现步骤摘要】
一种高产窄分布果胶寡糖的黑曲霉和果胶酶及其应用
本专利技术属于微生物发酵及其酶工程化应用领域，具体涉及一种高产窄分布果胶寡糖的黑曲霉(Aspergillusniger)1805及所产的果胶寡糖的应用。
技术介绍
果胶是一类结构复杂的杂多糖，由D-吡喃半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的主链，以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、和木糖等组成侧链。主要由均聚半乳糖醛酸(HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(RG-II)3个结构区域构成。果胶降解产生的果胶寡糖，具有抗菌、抗肿瘤和抑制毒素等作用，在控制棉花黄萎病、苹果花叶病和辣椒病毒病等方面效果显著。目前，果胶寡糖制备常用的方法有酸法、酶法、超声波法。酶法降解条件温和、无污染、特异性强，是最为理想的方法。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称。果胶酶广泛分布于高等植物和微生物中,在某些原生动物和昆虫中也有发现。在微生物中，细菌、放线菌、酵母和霉菌都能合成果胶酶。果胶酶一般分为原果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。随着我国食品工业和饲料工业的逐步发展，对果胶酶的需求也逐渐增长，但是由于我国对果胶酶的研究起步较晚，存在着诸多不足，如酶活力普遍较低、应用效果不佳等，严重影响着果胶酶的开发和生产。近年来国内也重视了果胶酶的应用和开发,特别是许多研究单位对果胶酶产生菌的筛选及诱变进行了积极的研究。目前国内所报道的果胶酶产生菌大多为黑曲霉，虽其果胶酶组分较为齐全，但混合酶的产物较杂，功能活性不清，质量不稳，不能满足国内市场日益增长的需要。可见要提高我国果胶酶制剂的质量，关键因素是要选育出适合于工业生产的产一定纯度特定果胶寡糖的高产菌。而天然菌株产果胶酶的活力一般都比较低，所得产物分布太广，产品的质量较低。果胶利用菌种的选育具有方法快速、简单、收效明显等特点，因而被广泛应用于产果胶寡糖中。而菌种的发酵产酶水平除了与其原始的生理特性及遗传改良有关外，工艺条件的优化也是充分体现生产性能的必要环节，筛选的菌株要在合适的工艺条件下得以体现，因此有必要对筛选菌的发酵工艺条件进行研究。应用黑曲霉产的果胶酶进行果汁澄清具有安全，高效，经济等特点。同时，对果汁的营养成分影响也很小。本专利以商业化果胶为底物，从甘橙中选出黑曲霉作为出发菌株，通过优化其产酶条件，从而降低发酵产酶成本，获得了高产果胶酶的黑曲霉，具有活性高、稳定性好、产物特异高等特点，可在大规模的果胶相关产业中得以应用。果胶寡糖是由2～20个α-1,4-D-半乳糖醛酸(GalA)残基构成的一种功能性低聚糖，部分半乳糖醛酸以甲酯的形式存在。黑莓寡糖酵素中的“果胶寡糖”是采用生物酶法降解黑莓鲜果中的果胶所得，具有生物活性功能。抗辐射、抗氧化活性果胶寡糖在生物体内抵抗超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(OH)、脂质自由基(RO，ROO)对机体的损伤，从而预防动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、癌症、囊型纤维化、帕金森病、老年痴呆症等神经退行性疾病。促进肠道有益菌(双歧杆菌)的增殖活性因肠道内的有益菌群双歧杆菌能专门酵解吸收果胶寡糖，而肠道中其他有害菌群则无能力酵解利用果胶寡糖，故果胶寡糖具有促进双歧杆菌增殖活性，产生解毒排毒、防治腹泻、改善肠环境、预防肠道癌症、延缓衰老等一系列特殊整肠保健功能，提高机体整体免疫力。增强机体免疫力活性果胶寡糖可有效激活和促进机体特异性和非特异性免疫系统，明显增加细胞膜渗出液中一种具有较强免疫活性的巨噬细胞—多形核白细胞的数量，从而激活机体的免疫系统。抗菌消炎具有抗绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌等感染以及提高免疫功能低下患者的抗真菌感染能力。除上述之外，果胶寡糖由于难被唾液酶和小肠消化酶水解，人体难以消化吸收，只能被肠道细菌吸收利用，其热量很低，不会导致肥胖；并且低聚糖属非胰岛素所依赖，不会使血糖升高，适合于高血糖人群和糖尿病人食用。果胶寡糖的活性与其结构密切相关，果胶寡糖被认为是新的益生元，它具有多种促进健康的特性。它可以刺激人结肠腺癌细胞的凋亡过程，对心血管组织具有保护作用，减少金属所致的损伤，具有抗肥胖，抗毒，抗菌，抗氧化等功能。果胶寡糖也被用于治疗胃肠疾病，糖尿病和高胆固醇血症。具体而言，该寡糖可以增加胃肠道中的益生菌菌群，如真杆菌属(LactobacillusEubacterium)，粪肠杆菌属(Faecalibacterium)等。同样，该寡糖增加双歧杆菌种群，但不刺激梭菌的生长。苹果果胶中的阿拉伯寡糖可被双歧杆菌，长双歧杆菌，普通拟杆菌和乳酸杆菌选择。果胶寡糖可以促进从年轻人到老年人的所有人群中双歧杆菌的生长，并增加了他们的免疫调节能力。目前，果胶寡糖的制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法等。其中，化学合成方法成本高、产率低，且在生产过程中涉及到有毒溶剂，存在化学试剂残留，因此安全方面存在隐患；植物富集法依赖于种植业，受到气候、地域等影响较大，产量不稳定，难以满足日益增长的需要。微生物合成法主要是利用微生物发酵，通过筛选优良、高产且稳定的微生物菌株，发酵生产果胶寡糖，主要包括乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、谷氨酸棒状杆菌等。然而，目前通过微生物发酵生产果胶寡糖的产物混杂，活性不清，产物质量和产量还较低，主要有以下几个原因：(1)微生物培养产生的果胶酶多为混合酶，大大降低了产物切割的特异性，导致产物分布广，活性不清；(2)由于果胶寡糖是水溶性，因而从发酵产物中提取果胶寡糖的工艺比较复杂。(3)有些产果胶酶的菌种安全性未知，所生产的果胶寡糖难以用于食品工业。因此筛选食品级并能够表达较高纯度果胶酶的菌株，用来生产分布窄的果胶寡糖是非常必要的。黑曲霉是一种常见的食品级霉菌，在自然界中分布十分广泛。黑曲霉在果胶寡糖生产制备中扮演着十分重要的角色，由于其能产生活性很强的淀粉酶，在酿酒工业上常用作淀粉质原料的糖化菌，我国最早利用根霉糖化淀粉(阿明诺法)生产酒精。黑曲霉在生长过程中能够产生苹果酸、果胶寡糖、乳酸、柠檬酸、富马酸等多种有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料以及环境等领域。因此可以采用根霉来生产果胶寡糖，用于食品与医药行业。本专利技术筛选到一株高产果胶寡糖黑曲霉株，对该菌进行了鉴定，对生产果胶寡糖的培养条件进行了初步研究，为微生物合成果胶寡糖工业化提供了基础。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种高产果胶酶的黑曲霉(Aspergillusniger)1805，该菌于2018年5月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.15670。本专利技术的黑曲霉(Aspergillusniger)1805是从大连甘橙园的果皮中筛选培养出来。其真菌分类学表明：该菌菌丝体起初呈白色，约48-72h后菌落颜色逐渐变成灰黑色。常规方法提取真菌的18srDNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，经18srDNA序列分析表明，其属于黑曲霉(Asperg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑曲霉，其为黑曲霉(Aspergillus niger)1805，其保藏号为：CGMCC No.15670。/n

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉，其为黑曲霉(Aspergillusniger)1805，其保藏号为：CGMCCNo.15670。


2.一种权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于：该黑曲霉由甘橙的果皮分离得到。


3.一种权利要求1所述的黑曲霉的应用，其特征在于：其发酵能产生的果胶酶。


4.根据权利要求3所述的黑曲霉的应用，其特征在于：经SDS-PAG分析其发酵能产生单一果胶酶条带，该酶在pH3.5-6.5之间具有较强稳定性。


5.一种权利要求3或4所述黑曲霉发酵获得的果胶酶，其特征在于：该酶在pH3.5-6.5之间具有较强稳定性，可耐受果胶发酵产物导致的酸性环境。

【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，谭海东，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21