循环肿瘤细胞阴性富集检测方法技术

本发明专利技术提供了一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。基于本发明专利技术的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法可以有效提高单核细胞层中CTCs的纯度，从而降低后续鉴定工作的复杂程度，提高鉴定的效率和准确率。

Detection of negative enrichment of circulating tumor cells

【技术实现步骤摘要】
循环肿瘤细胞阴性富集检测方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞(circulatingTumorCells，CTCs)阴性富集检测方法是指通过剔除血液中除CTCs以外其他血细胞来达到富集血液中CTCs的目的，剔除方法主要采用的是密度梯度离心方式，即将血液与一种介质(密度梯度离心液)混合后，通过离心力使血液中细胞根据自己的密度达到分离分层的目的，经过梯密度离心的血液样本会分成4层，由上至下依次为：血浆、单核细胞、分离液(密度梯度离心液)以及红细胞和白细胞；CTCs作为单核细胞会处于单核细胞层，所以只需再将单核细胞层提取出来，即达到了血液中CTCs的富集目的。但是现有的CTCs阴性富集检测方法存在以下不足：1)现有方法中CTCs阴性富集会将单核细胞层的样本全部提取出来，这一层里含有大量的白细胞，所以CTCs的富集纯度不够高，会对后续的鉴定工作增加复杂程度，影响鉴定效率和准确率；2)CTCs阴性富集分层效果和血液样本有关，尤其是红细胞，在密度梯度离心后，有些血液样本会出现红细胞上窜，与单核细胞层无法严格区分开来，导致最终CTCs富集纯度降低，并严重干扰后续的鉴定工作；3)在血液样本出现红细胞上窜时，通常采取裂红的方式将单核细胞层里的混入的红细胞去除掉，这样操作对其他单核细胞的完整性会产生副作用，并且因为裂红而增加了清洗步骤，使得最终细胞的回收率受影响；4)由于CTCs阴性富集检测方法包含从血液中富集CTCs，以及后续的染色鉴定过程，流程较长，需要多个环节的清洗和更换试管，在这一完整流程中，会导致细胞的丢失，影响最终检测的灵敏度。针对现有技术中CTCs阴性富集检测方法存在的不足，本领域技术人员一直在寻找解决的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，以解决使用现有技术中CTCs阴性富集检测方法存在的不足。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括如下步骤：S1：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；S2：利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，执行S2具体包括如下步骤：将所述第一离心管放在摇床上孵育；向带有插件的第二离心管中加入密度梯度离心液，将孵育好的所述第一离心管中的全血样本转入所述第二离心管中；将所述第二离心管放置于离心机中进行离心，离心后全血样本中单核细胞层位于所述插件上方，含有耦联在一起的红细胞和白细胞位于所述插件下方；将进行离心后位于所述第二离心管中插件上方的样本倒入第三离心管。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，在执行S2之后，还包括如下步骤：S3：利用细胞荧光抗体悬浮染色来标记CTCs，并基于扫描采集的荧光信号，通过细胞染色和形态来鉴定CTCs。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，在S3中，所述细胞荧光抗体包括：抗人EpCAM的细胞表面上皮细胞黏附分子抗体、抗人CK的细胞角蛋白抗体、细胞核染料DAPI和抗人CD45的白细胞特异性抗体。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，在S3中，通过荧光扫描仪进行荧光信号的采集，并根据细胞染色和形态鉴定CTCs。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，将符合DAPI+且CK/EpCAM+且CD45-染色特征和细胞形态学特征的细胞定义为CTCs。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，执行S3具体包括如下步骤：向所述第三离心管中加入细胞稀释液，并依次进行混匀，离心；将进行离心后的第三离心管中样本去上清后，加入细胞固定液进行固定、透化，然后加入细胞洗液，进行离心；弃上清，向所述第三离心管中加入细胞核染料、细胞角蛋白、EpCAM、CD45避光孵育染色；向所述第三离心管中再次补充细胞洗液，进行离心；弃上清，将所述第三离心管中样本转移到96孔读数板中，进行扫描和图像分析。可选的，在所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，所述细胞核染料为DAPI。在本专利技术所提供的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法中，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。基于本专利技术的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法可以有效提高单核细胞层中CTCs的纯度，从而降低后续鉴定工作的复杂程度，提高鉴定的效率和准确率。附图说明图1是本专利技术一实施例中循环肿瘤细胞阴性富集检测方法的流程图；图2是本专利技术一实施例中所有样本结果数据的线性回归分析结果示意图；图3是本专利技术一实施例中检出下限实验拟合曲线；图4是本专利技术一实施例中高、低浓度样本检测掺入细胞回收率散点图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术提出的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本专利技术的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本专利技术实施例的目的。为使本专利技术的目的、特征更明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步的说明，然而，本专利技术可以用不同的形式实现，不应认为只是局限在所述的实施例。请参考图1，其为本专利技术的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法的结构示意图。如图1所示，所述循环肿瘤细胞阴性富集检测方法包括：首先，执行步骤S1，向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；接着，执行步骤S2，利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集；其中，执行S2具体包括如下步骤：将所述第一离心管放在摇床上孵育；向带有插件的第二离心管中加入密度梯度离心液，将孵育好的所述第一离心管中的全血样本转入所述第二离心管中；将所述第二离心管放置于离心机中进行离心，离心后全血样本中单核细胞层位于所述插件上方，含有耦联在一起的红细胞和白细胞位于所述插件下方；将进行离心后位于所述第二离心管中插件上方的样本倒入第三离心管，即将位于所述插件上方的单核细胞层倒入第三离心管。其中，所述插件是一个透明，中间有微孔的塑料挡板，密度梯度离心后红细胞会在该插件下面，单核细胞层会在插件上方，可以直接将密度梯度离心管倒置，将插件上方的液体全部倒出，而插件下方的红细胞层样本会被挡住；相比于用枪头去吸取单核细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；/nS2：利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。/n

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；
S2：利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。


2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，执行S2具体包括如下步骤：
将所述第一离心管放在摇床上孵育；
向带有插件的第二离心管中加入密度梯度离心液，将孵育好的所述第一离心管中的全血样本转入所述第二离心管中；
将所述第二离心管放置于离心机中进行离心，离心后全血样本中单核细胞层位于所述插件上方，含有耦联在一起的红细胞和白细胞位于所述插件下方；
将进行离心后位于所述第二离心管中插件上方的样本倒入第三离心管。


3.如权利要求2所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，在执行S2之后，还包括如下步骤：
S3：利用细胞荧光抗体悬浮染色来标记CTCs，并基于扫描采集的荧光信号，通过细胞染色和形态来鉴定CTCs。


4.如权利要求3所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，在S3中，所述细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：温冬，金炜翔，
申请(专利权)人：骏实生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31