用于乳腺癌HER2基因检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于乳腺癌HER2基因检测的引物组、试剂盒及方法，利用本发明专利技术可以简便、高通量地检测乳腺癌患者中HER2基因是否发生扩增，与检测金标准FISH法相比，具有检测灵敏度高、时间短、价格低廉、通量高的优势，适合于大规模临床开展，进而，可为临床医生选择靶向药物提供参考，降低治疗风险以及减轻患者负担。

Primer set, kit and method for detection of HER2 gene in breast cancer

【技术实现步骤摘要】
用于乳腺癌HER2基因检测的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及基因检测
，具体涉及用于乳腺癌HER2基因检测的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
原癌基因人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上，具有酪氨酸激酶活性。它会抑制细胞凋亡，促进增殖，增加肿瘤细胞的侵袭力。HER2基因突变检测是预测HER2靶向疗法潜在效果的生物标志。大约有20％-30％原发浸润性乳腺癌患者表现为HER2阳性，就是细胞表面HER2蛋白受体表达大量增加，导致HER2基因细胞核内拷贝数增加。相较于其它类型的乳腺癌，HER2阳性乳腺癌进展速度更快、恶性程度更高，同时也更容易发生其他部位的转移，预后情况也相对较差。赫赛汀是一种可以抑制HER2过表达肿瘤细胞增殖的单抗药物，所以对于HER2阳性乳腺癌患者而言，准确的判断对确保最有可能获益的患者接受HER2靶向治疗至关重要；同时，那些不太可能获益的人可以避免与这些药物有关的副作用和成本。目前临床已有的检测方法包括免疫组化和原位杂交。免疫组化就是利用免疫显色反应在蛋白水平上对福尔马林固定的石蜡切片进行HER2过表达检测。原位杂交就是利用特别设计的核酸探针与固定的细胞内HER2基因进行序列杂交，缺点是耗时较长，价格较高，无法得到确切的阳性结果。对于HER2免疫组化阳性结果不确定的情况，还需要用FISH方法检测确定HER2基因扩增状态。虽然FISH技术被认为是目前检测HER2基因是否扩增的“金标准”。但是其检测操作繁琐，流程较长，不同的抗体敏感性存在差异，在实验室很难进行标准化的检测。
技术实现思路
针对上述传统乳腺癌HER2基因检测方法中存在的操作繁琐、准确性低、敏感性不高、难以标准化等问题，本专利技术基于HS-MSH技术提供了用于乳腺癌HER2基因检测的引物组、试剂盒及方法，操作简单、准确性高、敏感性高且统一化标准。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种用于乳腺癌HER2基因检测的引物组，包括HER2正向引物和HER2反向引物，所述HER2正向引物和HER2反向引物包括：HER2正向引物F1：5'-ACATCCTGCTGTGGAGGACT-3'，HER2反向引物R1：5'-CGCCACGACTGGCTAATTT-3'；HER2正向引物F2：5'-ACTAGTTATTGGGCCGGACA-3'，HER2反向引物R2：5'-CGCCACGACTGGCTAATTT-3'；HER2正向引物F3：5'-TTTGCTACAGTGCAAAGACAC-3'，HER2反向引物R3：5'-GGTGGTCTCGAACTCCTGAC-3'。优选地，上述引物组还包括TSN内参基因的引物：TSN正向引物F4：5'-F1CCCATCACAGGACCAGAAGT-3'，TSN反向引物R4：5'-AGCTGCCAAGCCTCCTTTAT-3'。本专利技术还提供了一种包括上述引物组的试剂盒。优选地，上述试剂盒还包括PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品和饱和荧光染料。进一步地，所述PCR反应液包括：PCRbuffer、dNTPs、Taq酶和无核酸酶水。优选地，所述PCR反应液中PCRbuffer为5×PCRbuffer，dNTPs终浓度为0.2mM。优选地，HER2正向引物、HER2反向引物、TSN正向引物F4和TSN反向引物R4的终浓度均为0.4μM。本专利技术还提供了一种用于乳腺癌HER2基因检测的方法，包括如下步骤：1)提取待检测样本DNA，作为PCR扩增的模板；2)使用上述引物组对所述模板进行荧光定量PCR扩增，PCR扩增程序为：3)使用MS-HRM分析软件自动计算不同样品的相对荧光强度，用于检测HER2基因的扩增。优选地，步骤2)中采用的扩增体系为PCRbuffer10μL，dNTPs1μL，正向引物和反向引物各1μL，Taq酶0.1μL，模板2μL，用无核酸酶水补至25μL。本专利技术的有益效果如下：1.利用本专利技术的检测试剂盒可以简便、高通量地检测乳腺癌患者中HER2基因是否发生扩增，与检测金标准FISH法相比，具有检测灵敏度高、时间短、价格低廉、通量高的优势，适合于大规模临床开展。2.本专利技术的检测试剂盒通过荧光定量PCR扩增，由溶解曲线确定是否存在HER2基因扩增，进而，可为临床医生选择靶向药物提供参考，降低治疗风险以及减轻患者负担。附图说明图1显示的是以标准品DNA为模板的PCR结果绘制的标准曲线。图2显示的是以样品DNA为模板的PCR结果的高分辨溶解曲线。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合附图和实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术不仅仅局限于下面的实施例。实施例1乳腺癌HER2阳性细胞系SKBR3和HER2阴性细胞系ZR-75-1均购自上海细胞所。分别从中提取基因组DNA，按照突变频率从1％到10％的比例掺入基因组DNA，建立HER2/TSN比值梯度的模型。使用上述PCR扩增反应液加入相应反应成分。扩增体系为：5×PCRbuffer5μLdNTPs(10mM)0.5μL正向引物(10μM)1μL反向引物(10μM)1μLTaq酶(5U/μL)0.1μL模板2μL无核酸酶水15.4μL总体积25μL按照如下反应程序对标准品进行扩增。采用HER2阳性细胞和HER2阴性细胞的DNA，使用泊松公式计算TSN和HER2的绝对浓度，并应用Z-检验对logHER2/TSN比值(呈近似正态分布)对突变DNA量进行显著性检验。二者的比值差为1.23±0.04，0.19±0.06，-0.02±0.01，所以，通过这种方法，我们能够显著地检测突变DNA的存在。标准曲线如图1所示。本专利技术所述的阴性对照品和阳性对照品均为常规对照品，均为HER2基因片段和Fas基因片段的混合物。实施例2(1)使用QIAampCirculatingNucleicAcidKit(QIAGEN，Cat：55114)提取乳腺癌患者的游离核酸(经患者同意，医院收集的乳腺癌样品)，操作过程按照试剂盒说明书，最后把80μLBufferAVE加入到QIAampMini吸附柱中，20，000rpm离心1min，收集提取的核酸，然后使用NanoDropOne超微量分光光度计对所提取的样品进行检测，260/280范围是1.8-2.1，浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于乳腺癌HER2基因检测的引物组，包括HER2正向引物和HER2反向引物，所述HER2正向引物和HER2反向引物包括：/nHER2正向引物F1：5'-ACATCCTGCTGTGGAGGACT-3'，/nHER2反向引物R1：5'-CGCCACGACTGGCTAATTT-3'；/nHER2正向引物F2：5'-ACTAGTTATTGGGCCGGACA-3'，/nHER2反向引物R2：5'-CGCCACGACTGGCTAATTT-3'；/nHER2正向引物F3：5'-TTTGCTACAGTGCAAAGACAC-3'，/nHER2反向引物R3：5'-GGTGGTCTCGAACTCCTGAC-3'。/n

【技术特征摘要】
1.用于乳腺癌HER2基因检测的引物组，包括HER2正向引物和HER2反向引物，所述HER2正向引物和HER2反向引物包括：
HER2正向引物F1：5'-ACATCCTGCTGTGGAGGACT-3'，
HER2反向引物R1：5'-CGCCACGACTGGCTAATTT-3'；
HER2正向引物F2：5'-ACTAGTTATTGGGCCGGACA-3'，
HER2反向引物R2：5'-CGCCACGACTGGCTAATTT-3'；
HER2正向引物F3：5'-TTTGCTACAGTGCAAAGACAC-3'，
HER2反向引物R3：5'-GGTGGTCTCGAACTCCTGAC-3'。


2.根据权利要求1所述的用于乳腺癌HER2基因检测的引物组，其特征在于，还包括TSN内参基因的引物：
TSN正向引物F4：5'-F1CCCATCACAGGACCAGAAGT-3'，
TSN反向引物R4：5'-AGCTGCCAAGCCTCCTTTAT-3'。


3.用于乳腺癌HER2基因检测的试剂盒，包括权利要求1所述的用于乳腺癌HER2基因检测的引物组。


4.根据权利要求3所述的用于乳腺癌HER2基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括TSN内参基因的引物：
TSN正向引物F4：5'-F1CCCATCACAGGACCAGAAGT-3'，
TSN反向引物R4：5'-AGCTGCCAAGCCTCCTTTAT-3'。

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，刘琦，赵洪玉，
申请(专利权)人：苏州璞瑞卓越生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32