人循环肿瘤细胞MSI检测引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了人循环肿瘤细胞MSI检测引物组、试剂盒及检测方法，引物组检测人MSI状态时灵敏度高，特异性强；试剂盒则能够快速、高效、准确检测人循环肿瘤细胞MSI状态；而检测方法则具有结果真实可靠，室间一致性强，易于推广等优点。本发明专利技术针对循环肿瘤细胞检测进行优化，使之实现无创的基础上，检出结果灵敏度高、准确性高。

Primer set, kit and detection method of MSI in human circulating tumor cells

【技术实现步骤摘要】
人循环肿瘤细胞MSI检测引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及人循环肿瘤细胞MSI检测引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)是指脱离了肿瘤原发部位和转移部位而进入血液循环中的各类肿瘤细胞。CTC在肿瘤早期发现、指导用药、预后复发检测、肿瘤转移提示等方面有明显的优势：1)CTC对于恶性肿瘤进行早期诊断有意义，研究表明在早期的无症状的恶性肿瘤患者外周血中也可检测到少量的CTCs，而在良性疾病及健康体检者血液中未检出CTCs；2)CTCs与原发灶内瘤细胞具有相似的基因遗传学特征，能够实现无创、可持续性监测肿瘤病程，并指导用药；3)类似于肿瘤早期发现，预后可持续监测复发状况；4)CTC作为原发灶和转移灶之间的桥梁，携带了大量的肿瘤进展和转移的信息，具有极强的转移潜能，对肿瘤转移复发起到了至关重要的作用。微卫星(Microsatellite)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列。微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)是由错配修复(MMR)基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。表现为肿瘤细胞内由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度与正常细胞相比增长或缩短。目前检测肿瘤细胞中MSI有两种途径：1)分子水平：包括多重PCR-毛细管电泳、NGS；2)免疫组化。其中，多重荧光PCR-毛细管电泳法检测MSI状态是国际公认的金标准，被美国国立综合癌症中心(NCCN)、ASCO等国际知名机构联合推荐。此外，多重PCR-毛细管电泳在高通量检测上有一定的优势。2017年5月23日，FDA首次批准了PD-1抗体药物Keytruda用于dMMR/MSI-H型实体瘤的治疗，它是一种仅依照分子标志物进行区分的抗肿瘤疗法。说明指出，具有dMMR/MSI-H型特征的实体瘤患者更能在Keytruda解除免疫抑制作用后获益。所以临床通过肿瘤微卫星不稳定性(MSI)检测区分出MSI-H实体瘤患者。然而，目前国内并无数据指出那些位点Panel能更精确的指示MSI状态。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术开发了人循环肿瘤细胞MSI检测引物组、试剂盒及检测方法，针对循环肿瘤细胞检测进行优化，使之实现无创的基础上，检出结果灵敏度高、准确性高。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种人循环肿瘤细胞MSI检测引物组，包括针对5个MSI检测代表位点BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250检测的5对荧光标记引物，所述引物及其荧光标记如下：优选地，上述引物组还包括2个内标位点PentaC、PentaE的2对荧光标记引物，引物及其荧光标记如下：本专利技术还提供了一种人循环肿瘤细胞MSI检测试剂盒，包括上述检测引物组。优选地，上述检测试剂盒还包括MultiPlex缓冲液，MultiPlexDNA聚合酶。优选地，上述检测试剂盒还包括内参标志物(如DDLIZE500)和阴性对照样品(如K562gDNA)。本专利技术另提供了人循环肿瘤细胞MSI检测方法，包括如下步骤：1)将扩增混合物分装到PCR反应管底部并分别加入CTCs样本、阴性对照样品及阴性对照，所述扩增混合物包括MultiPlex缓冲液、MSI引物混合液、MultiPlexDNA聚合酶和NFH2O，所述CTCs样本中CTCs的个数不少于20个/μl；2)将PCR反应管转移到PCR仪上进行PCR扩增，扩增条件如下：3)制备待分析样品，对PCR扩增产物进行毛细管电泳检测；4)对步骤3)输出的数据进行分析，以确定检测样品的MSI状态。优选地，步骤1)中通过以下方法获得CTCs样本：取肿瘤患者全血离心分离血浆、白细胞，将白细胞用PBS重悬，采用系统富集CTCs，且用1μl的PBS重悬不少于20个的CTCs。优选地，步骤3)中采用内参标志物DDLIZE500指示35-500bp以内的片段长度。优选地，步骤3)中使用Applied3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳检测。优选地，步骤4)中使用5软件对步骤3)输出的数据进行分析。本专利技术的有益效果如下：一、本专利技术提供了检测人循环肿瘤细胞MSI状态的引物、探针，包括7对荧光标记引物，其中5个为NCCN、ASCO等国际知名机构联合推荐的MSI检测代表位点，2个为内标位点，5个检测代表位点中包括两个单核苷酸重复序列位点(BAT-25、BAT-26)，3个双核苷酸重复序列位点(D2S123、D5S346、D17S250)，2个五核苷酸重复序列内标位点PentaC、PentaE。该引物、探针检测人MSI状态时灵敏度高，特异性强。二、本专利技术提供了检测人循环肿瘤细胞MSI状态的试剂盒，其中，本专利技术提供了配套内参标志物DDLIZE500，指示35-500bp以内的片段长度；本专利技术还提供了阴性对照样品，将K562细胞系提取gDNA稀释至50pg/μl作为本检测试剂盒的阴性对照样品，每批次检测添加阴性对照样品，并设置阴性对照(水对照)以校验检测批次的准确性。该试剂盒能够快速、高效、准确检测人循环肿瘤细胞MSI状态。三、本专利技术提供了检测人循环肿瘤细胞MSI状态的检测方法，优化了直扩体系，不需要提取，按要求加入处理好的CTCs及对照白细胞即可实现一个完整的检测，传统的肿瘤组织检测起始量为2ng，本专利技术能够从50pg及以上的CTCs中得到灵敏度高、准确性高的检测结果，适用机型为经过认证的Applied3500Dx基因分析仪，输出数据可以用5软件(AppliedBiosystems)进行分析，以确定检测样品的MSI状态。此外，本专利技术提供了分析相关Panels文本文件，允许使用软件自动分配基因型，进而具有更广泛的应用基础，相关研究数据更充足，对于用药指导更易找到研究依据。该检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，具有结果真实可靠，室间一致性强，易于推广等优点。附图说明图1是DDLIZE500内参示例。图2是本专利技术实施例中MSS临床样本示例。图3是本专利技术实施例中阴性对照样本示例。图4本专利技术实施例中MSI-L临床样本示例。图5本专利技术实施例中MSI-H临床样本示例。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合附图和实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术不仅仅局限于下面的实施例。实施例一、仪器和试剂(一)仪器1、PCR仪Bio-RADC100096孔梯度扩增仪(1851197)。2、系统目前，系统是唯一获得FDA批准上市的产品，该系统利用包被肿瘤细胞上皮标志物EpCAM抗体的免疫磁珠富集法正向富集的方式从循环血中分离CTCs。3、ABI3500Dx遗传分析仪(二)试剂1、PBS1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人循环肿瘤细胞MSI检测引物组，包括针对5个MSI检测代表位点BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250检测的5对荧光标记引物，所述引物及其荧光标记如下：/n

【技术特征摘要】
1.人循环肿瘤细胞MSI检测引物组，包括针对5个MSI检测代表位点BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250检测的5对荧光标记引物，所述引物及其荧光标记如下：





2.根据权利要求1所述的人循环肿瘤细胞MSI检测引物组，其特征在于，还包括2个内标位点PentaC、PentaE的2对荧光标记引物，引物及其荧光标记如下：





3.人循环肿瘤细胞MSI检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的人循环肿瘤细胞MSI检测引物组。


4.根据权利要求3所述的人循环肿瘤细胞MSI检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括MultiPlex缓冲液，MultiPlexDNA聚合酶。


5.根据权利要求4所述的人循环肿瘤细胞MSI检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内参标志物和阴性对照样品。


6.人循环肿瘤细胞MSI检测方法，包括如下步骤：
1)将扩增混合物分装到PCR反应管底部并分别加入CTCs样本、阴性对照样品及阴性对照，所述扩增混合物包括MultiPlex缓冲液、MSI引物混合液、Mul...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，杨丽萍，赵洪玉，
申请(专利权)人：苏州绘真医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32