检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法技术

本发明专利技术提供一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，涉及干细胞与再生医学领域。本发明专利技术的检测方法，包括分组培养、刺激T淋巴细胞、检测等步骤，根据共培养组和对照组的检测结果判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。本发明专利技术的方法能够更精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。

The method of detecting the effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on T lymphocyte differentiation

【技术实现步骤摘要】
检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法
本专利技术涉及干细胞与再生医学领域，特别是涉及一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞是一种多功能干细胞，免疫调节是评价脐带间充质干细胞功能的重要指标之一。T淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成，T淋巴细胞在经抗原刺激等条件激活后，可分化为多种细胞亚群，探究脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响，有助于更好的理解间充质干细胞对机体免疫系统的调节作用，为未来干细胞临床应用提供更加全面的临床前研究证据。现有检测脐带间充质干细胞对淋巴细胞分化的方法不够全面，因而得到的结论也有待商榷。
技术实现思路
基于此，有必要针对现有的检测方法不够全面的问题，提供一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，能够更加精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，包括以下步骤：分组培养：将获取的T淋巴细胞液分为共培养组和对照组，向共培养组中加入CD3抗体、CD28抗体和脐带间充质干细胞，向对照组中加入与共培养组等量的CD3抗体和CD28抗体，将共培养组和对照组放置于相同的条件下培养2～7天；刺激T淋巴细胞：向共培养的细胞液中加入Cocktail，反应2～4h，收集悬浮细胞；检测：检测所述悬浮细胞中细胞活化标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度；根据共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。上述检测方法，将T淋巴细胞和脐带间充质干细胞进行共培养，加入CD3抗体和CD28是为了体外模拟T细胞在体内接受抗原提呈细胞刺激的过程，检测前加入Cocktail可以激活T淋巴细胞，促进T淋巴细胞合成细胞因子，同时抑制高尔基体转运分泌蛋白到细胞外，以便采用流式检测细胞因子的表达情况；检测时采用多种细胞标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B等表征相应T淋巴细胞亚群变化，其中CD4+Foxp3+为Treg细胞，CD4+IFN-r+为Th1细胞，CD4+IL-4+为Th2细胞，CD4+IL-17+为Th17细胞，CD4+IL21+为Th21细胞，CD8+颗粒酶B+为杀伤性T细胞，将共培养组和对照组对比，能够精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。在其中一个实施例中，所述共培养步骤中，所述T淋巴细胞的获取方法包括以下步骤：稀释：将血液与生理盐水混合得到稀释血液；离心：将稀释血液加至淋巴细胞分离液中，离心；分离：离心后，去除上层液体，保留沉淀，加入PBS重悬，离心，舍弃上层液体，保留沉淀，加入1640培养基和5～20％的血清重悬，得到T淋巴细胞液。在其中一个实施例中，所述稀释步骤中，所述血液与所述生理盐水的体积比为1:(2～3)。优选地，血液与生理盐水的体积比为1:2.5。在其中一个实施例中，所述离心步骤中，所述淋巴细胞分离液与血液的体积比为(1～2)：1。优选地，淋巴细胞分离液液与血液的体积比为1.5:1。在其中一个实施例中，所述离心步骤中，离心温度为18～22℃，离心时间为18～22min，升速为7，降速为0。血液刚加在淋巴液上层，升速应略缓慢；离心结束后，淋巴细胞层已经分离出来，此时降速应最小，防止扰动。在其中一个实施例中，所述分离步骤中，离心温度为4±1℃，离心时间为7～9min，升速为9，降速为9。淋巴细胞已经分离出来，为尽可能地缩短分离时间，将升降速调到最大。在其中一个实施例中，所述分组培养步骤中共培养组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×106个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mLCD28抗体，再加入脐带间充质干细胞液，所述T淋巴细胞与所述脐带间充质干细胞的数量比为(48～52)：1，进行共培养；所述分组培养步骤中对照组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×106个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mLCD28抗体，进行培养。在其中一个实施例中，所述刺激T淋巴细胞步骤中，所述Cocktail包括佛波酯、离子霉素和布雷非德菌素A。在其中一个实施例中，所述佛波酯终浓度为19～21ng/mL，离子霉素浓度为0.8～1.2μg/mL，布雷非德菌素A浓度为14～16μg/mL。优选地，佛波酯终浓度为20ng/mL，离子霉素浓度为1μg/mL，布雷非德菌素A浓度为15μg/mL。在其中一个实施例中，所述Cocktail的添加量为3～5μg/孔。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的检测方法，将T淋巴细胞和脐带间充质干细胞进行共培养，加入CD3抗体和CD28是为了体外模拟T细胞在体内接受抗原提呈细胞刺激的过程，检测前加入Cocktail可以激活T淋巴细胞，促进T细胞合成细胞因子，同时抑制高尔基体转运分泌蛋白到细胞外，以便采用流式检测细胞因子的表达情况；检测时采用多种细胞标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B等表征相应T淋巴细胞亚群变化，其中CD4+Foxp3+为Treg细胞，CD4+IFN-r+为Th1细胞，CD4+IL-4+为Th2细胞，CD4+IL-17+为Th17细胞，CD4+IL21+为Th21细胞，CD8+颗粒酶B+为杀伤性T细胞，将共培养组和对照组对比，能够精确、全面的检测脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。附图说明图1为实施例Foxp3的表达情况图；图2为实施例IL-17的表达情况图；图3为实施例IL-21的表达情况图；图4为实施例IFN-γ的表达情况图；图5为实施例IL-4的表达情况图；图6为实施例颗粒酶B的；图7为实施例和对比例的IL-21和颗粒酶B表达情况图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。实施例1一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，包括以下步骤：1)向10mL健康人捐赠的血液中加入25mL生理盐水，混合均匀，得到稀释血液，向50mL离心管中缓慢加入15mL淋巴细胞分离液，倒入时离心管壁上不要有残留，将稀释血液缓慢加在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n分组培养：将获取的T淋巴细胞液分为共培养组和对照组，向共培养组中加入CD3抗体、CD28抗体和脐带间充质干细胞，向对照组中加入与共培养组等量的CD3抗体和CD28抗体，将共培养组和对照组放置于相同条件下培养2～7天；/n刺激T淋巴细胞：向共培养的细胞液中加入Cocktail，反应2～4h，收集悬浮细胞；/n检测：检测所述悬浮细胞中细胞活化标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度；根据共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分组培养：将获取的T淋巴细胞液分为共培养组和对照组，向共培养组中加入CD3抗体、CD28抗体和脐带间充质干细胞，向对照组中加入与共培养组等量的CD3抗体和CD28抗体，将共培养组和对照组放置于相同条件下培养2～7天；
刺激T淋巴细胞：向共培养的细胞液中加入Cocktail，反应2～4h，收集悬浮细胞；
检测：检测所述悬浮细胞中细胞活化标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度；根据共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养步骤中，所述T淋巴细胞的获取方法包括以下步骤：
稀释：将血液与生理盐水混合得到稀释血液；
离心：将稀释血液加至淋巴细胞分离液中，离心；
分离：离心后，去除上层液体，保留沉淀，加入PBS重悬，离心，舍弃上层液体，保留沉淀，加入1640培养基和5～20％的血清重悬，得到T淋巴细胞液。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述稀释步骤中，所述血液与所述生理盐水的体积比为1:(2～3)。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心步骤中，所述淋巴细胞分离液与血液的体积比为(1～2)：1。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚一凡，江嘉豪，何美第，陈炽锋，刘锐，王进辉，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44