一种人脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法与应用，其组成包括：基础培养基、氨基酸类物质、微量元素、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和缓冲盐；所述氨基酸类物质包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。本发明专利技术提供的无血清培养基成分清晰且批次稳定，不含血清、抗生素和其他血清类似物，因此，无异源性污染和免疫排斥风险，使用更加安全；该培养基能够保持细胞正常贴壁、生长状态佳、且具备干性，更适合于人脐带间充质干细胞的生长和干性维持。

A serum-free medium for human umbilical cord mesenchymal stem cells and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法与应用
本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种人脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法与应用。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymaLStemCeLL，MSC)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、基质细胞等多种细胞，且具备免疫调节、组织修复、炎症趋化等功能，能够从骨髓、脂肪、脐带、胎盘等多种组织中分离获取。由于MSC免疫原性低、增殖能力强，近年来被广泛应用于临床疾病的治疗以及医疗美容。骨髓来源的间充质干细胞是研究最早的一种获取方式，但是其取材要求严苛，且对供体的伤害较大，因此应用受到局限。近年来，脂肪干细胞和脐带干细胞的分离技术逐渐成熟，取材也更为方便。尤其是脐带间充质干细胞较其他来源干细胞相比，免疫原性更低、增殖能力更强，在应用中的优势最为明显。但是，脐带组织中的直接分离出来的间充质干细胞含量有限，若要广泛应用，必须通过扩增获取大量的细胞，如果应用于人体，还需保证细胞有足够纯度，无菌、无病原体及内毒素，且具备极佳的增殖分化能力。因此，优化干细胞体外培养体系的研究具有十分重要的意义。目前，常规的培养体系是在基础培养基中加入动物血清，比如胎牛血清、新生小牛血清，但动物血清的成分复杂不清晰，批次不稳定，可能携带病原体，残存于细胞内的血清也可能引发免疫问题，存在较多安全隐患。现有研究利用人的血清、血浆、血小板及其衍生物等替代异源性血清提供干细胞所需生长因子及营养成分，在安全性方面得到了一定改善，但依旧成分不明确，批次不稳定，受血清供体影响大，并存在免疫排斥风险，且来源有限。随着研究深入，无血清培养体系开始建立，自2008年Invitrogen公司推出了专用于骨髓间充质细胞培养的无血清培养基MSCSFM后，R&D、StemceLL等公司也先后推出了商业化的间充质干细胞无血清培养基，但市售的培养基价格昂贵，需额外添加多种因子所以保存时间有限，细胞增殖效率不够理想。常规脐带间充质干细胞培养体系中添加的胎牛血清或新生小牛血清成分不明、可能携带病原体。用人血小板、血清、血浆等自体提取物替代胎牛血清或新生小牛血清受供体影响较大，且来源有限。同时，目前商用无血清培养基价格昂贵，保存时间短且细胞增殖效果不理想。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，既能解决常规培养体系所带来的安全隐患，又比常规培养体系更适合于间充质干细胞的生长，保证培养成分稳定，批次间无差异，适用于大规模应用。本专利技术还提出一种上述无血清培养基的制备方法。本专利技术还提出一种具有上述无血清培养基在人脐带间充质干细胞培养中的应用。根据本专利技术的第一方面实施例的人脐带间充质干细胞无血清培养基，组成包括：基础培养基、氨基酸类物质、微量元素、人血清白蛋白、转铁蛋白、人胰岛素、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和缓冲盐；其中，所述氨基酸类物质包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。根据本专利技术实施例的人脐带间充质干细胞无血清培养基，至少具有如下有益效果：本专利技术提供的无血清培养基成分清晰且批次稳定，不含血清、抗生素和其他血清类似物，因此，无异源性污染和免疫排斥风险，使用更加安全；该培养基能够保持细胞正常贴壁、生长状态佳、且具备干性，更适合于人脐带间充质干细胞的生长和干性维持。根据本专利技术的一些实施例，所述人血清白蛋白、人胰岛素和人表皮生长因子均为重组蛋白。根据本专利技术的一些实施例，所述基础培养基为DMEM/F12型培养基、MEM型培养基、IMDM型培养基和Ham’sF12型培养基中的至少一种。根据本专利技术的一些实施例，所述微量元素为亚硒酸钠。根据本专利技术的一些实施例，所述缓冲盐为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyL)piperazin-1-yL]ethanesuLfonicacid，HEPES)。根据本专利技术的一些实施例，所述人脐带间充质干细胞无血清培养基的组成包括DMEM/F12型培养基，还包括以下浓度的组分：甘氨酸(1-10)mg/L、丙氨酸(1-10)mg/L、天冬酰胺(1-20)mg/L、天冬氨酸(1-20)mg/L、谷氨酸(1-20)mg/L、脯氨酸(1-15)mg/L、丝氨酸(1-15)mg/L、谷氨酰胺(1-10)mM、亚硒酸钠(5-10)ng/mL、重组人血清白蛋白(1-10)mg/mL、转铁蛋白(1-10)μg/mL、重组人胰岛素(5-25)μg/mL、重组人表皮生长因子(1-10)ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子(1-10)ng/mL和HEPES(10-25)mM。根据本专利技术的一些实施例，所述人脐带间充质干细胞无血清培养基的组成包括DMEM/F12型培养基，还包括以下浓度的组分：甘氨酸7.5mg/L、丙氨酸8.9mg/L、天冬酰胺13.2mg/L、天冬氨酸13.3mg/L、谷氨酸14.7mg/L、脯氨酸11.5mg/L、丝氨酸10.5mg/L、谷氨酰胺5mM、亚硒酸钠5ng/mL、重组人血清白蛋白10mg/mL、转铁蛋白5.5μg/mL、重组人胰岛素10μg/mL、重组人表皮生长因子10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子10ng/mL和HEPES(10-25)mM。根据本专利技术的第二方面实施例的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤，向所述基础培养基中，加入氨基酸类物质、微量元素、人血清白蛋白、转铁蛋白、人胰岛素、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和缓冲盐，搅拌均匀后制得。根据本专利技术的第三方面的实施例的无血清培养基在人脐带间充质干细胞培养中的应用。本专利技术所述培养基不含血清、抗生素和其他血清类似物，因此，无异源性污染和免疫排斥风险，使用更加安全。该培养基能够替代间充质干细胞常规培养体系中的血清培养基，保持细胞正常贴壁、生长状态佳、且具备干性，更适合于人脐带间充质干细胞的生长和干性维持。相较于市售培养基，本专利技术培养基成本更低、成分更清晰且批次间稳定性更好。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为使用本专利技术实施例1中培养基3培养的干细胞在P1、P2和P6代的显微镜成像图；图2为本专利技术实施例2中不同组分浓度培养基的对照实验结果图；图3为本专利技术实施例3中P3代人脐带间充质干细胞在不同培养基中的增殖曲线对照图；图4为本专利技术实施例3中P6代人脐带间充质干细胞在不同培养基中的增殖曲线对照图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术的实施例一为：人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备和使用：一、无血清培养基的配制：为研究人血清白蛋白、转铁蛋白和重组人胰岛素浓度对本专利技术培养基的影响，配制培养基1-9进行对比实验。培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞无血清培养基的组成包括：基础培养基、氨基酸类物质、微量元素、人血清白蛋白、转铁蛋白、人胰岛素、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和缓冲盐；其中，所述氨基酸类物质包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。/n

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞无血清培养基的组成包括：基础培养基、氨基酸类物质、微量元素、人血清白蛋白、转铁蛋白、人胰岛素、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和缓冲盐；其中，所述氨基酸类物质包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。


2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述人血清白蛋白、人胰岛素和人表皮生长因子均为重组蛋白。


3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12型培养基、MEM型培养基、IMDM型培养基和Ham’sF12型培养基中的至少一种。


4.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述微量元素为亚硒酸钠。


5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述缓冲盐为HEPES。


6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞无血清培养基的组成包括DMEM/F12型培养基，还包括以下浓度的组分：甘氨酸(1-10)mg/L、丙氨酸(1-10)mg/L、天冬酰胺(1-20)mg/L、天冬氨酸(1-20)mg/L、谷氨酸(1-20)mg/L、脯氨酸(1-15)mg/L、丝氨酸(1-15)mg/L、谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：许澎，黄巧，胡清云，
申请(专利权)人：湖南丰晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43