一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法，其步骤为斜面培养、种子液培养、液体发酵、制剂制备，制备的制剂剂型为液体制剂或可湿性粉剂。本发明专利技术在液体发酵培养基中加入中药浸提物，发酵结束后或将发酵产物直接处理后包装为液体制剂，或进行干燥分离，得到哈茨木霉菌丝体，再将浸提后的中药药渣干燥后粉碎，作为载体与菌丝体混合制成固体制剂，该液体制剂或固体制剂对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌均有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。

A liquid fermentation method and preparation method of Trichoderma harzianum for controlling potato root rot

【技术实现步骤摘要】
一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法。
技术介绍
哈茨木霉菌作为一种生防菌可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其中由镰刀菌侵染马铃薯引起的根腐病、干腐病、枯萎病是世界性的土传真菌病害，马铃薯根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，由多种镰刀菌引起的马铃薯镰刀菌根腐病近几年对马铃薯的生产危害严重，一般发病地块减产13％～35％，严重的成片死亡甚至绝产。马铃薯根腐病的防治一般采用化学杀菌剂进行处理，用化学药剂处理时往往存在残留问题，同时生产田中的镰刀菌不能除根，来年易复发等，因此使用哈茨木霉进行生物防治根腐病处理，环保安全有效，可进行长期防治。目前国外已有10余个商品化的木霉制剂问世，多为木霉孢子制剂，但木霉菌在植物病害防治中仍然存在很多问题，施用后在土壤中受温度、湿度、pH等因素影响，定殖能力不够理想，难以充分发挥药效，并且木霉菌对植物的促生增产作用不够显著。针对以上不足，国内外进行了多项研究，专利CN201811550295.4公开了一种哈茨木霉菌固体发酵方法、固体发酵产物、哈茨木霉菌剂及其制备方法和应用，能高效地防治葡萄霜霉病和葡萄灰霉病，还能有效促进葡萄生长和提高作物产量。专利CN200810154241.6公开了一种用中草药药渣发酵生防木霉的生产工艺，使用中药厂制药过程中的中药药渣作为培养基成分的一部分进行发酵生产生防木霉，以上两个专利均没有说明其得到的生防木霉活力如何，以及解决木霉发酵过程产量的问题，在生产上效果如何，对相关植物疾病的防治及促进增产作用不明显。
技术实现思路
基于以上现有技术，本专利技术的目的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法及制剂的制备方法，该方法通过液体发酵可以显著提高哈茨木霉的产量，同时制备的制剂对木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌等马铃薯根腐病的致病菌有很好的抑制效果，可以应用于马铃薯根腐病的防治过程，从而减少和防治马铃薯根腐病的发生，提高马铃薯的产量和质量。本专利技术所用的菌种哈茨木霉菌M-17，保藏编号：CCTCCNO：M2018538，拉丁文名称为TrichodermaharzianumM-17，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年8月13日，保藏地址为中国武汉武汉大学。本专利技术采用的技术方案为：一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法，包括以下步骤：步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上进行培养；步骤二、种子液培养，将步骤一培养好的斜面菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养；步骤三、液体发酵，将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；步骤四、制剂制备，将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成液体制剂或固体制剂。为了更好的实现本专利技术，进一步的，步骤一中PDA培养基制作方法为：1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。为了更好的实现本专利技术，进一步的，步骤一斜面培养条件为黑暗条件下，25～28℃培养5～7d；为了更好的实现本专利技术，进一步的，步骤二中种子培养基为蔗糖15～20g/L，酵母粉3～6g/L，NaCl0.01～0.05g/L，FeSO4·7H2O0.1～0.3g/L，MgSO4·7H2O1.2～1.5g/L，KH2PO43.5～4.5g/L，NaNO36.5～7.0g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，25～30min；接种量为1～2cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床25～28℃培养3～6d，摇床转速180～220rpm。为了更好的实现本专利技术，进一步的，步骤三中液体发酵培养基为碳源添加量为2％的小麦粉、玉米粉、马铃薯全粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉和麸皮粉中的一种或几种；氮源添加量为2％的黄豆粉、葡萄酒皮渣粉、硝酸铵、尿素、硫酸铵和硝酸钠中的一种或几种；其他微量元素添加量为1.4％的硫酸镁、硝酸钙、硫酸亚铁中的一种或几种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。为了更好的实现本专利技术，进一步的，步骤三中液体发酵培养基灭菌参数为蒸汽湿热灭菌，121～124℃维持25～35min，培养条件为25～28℃培养，通风比1:0.7v/v，开搅拌90～115rpm，培养10～13d。为了更好的实现本专利技术，进一步的，步骤四中其制剂的制备方法为：A哈茨木霉液体制剂制备工艺为：哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，pH为4.5～5.5，加入灭菌的0.1～0.5‰的甘油和0.05～0.1‰的植物油，灭菌条件为125℃45～60min；混合搅拌均匀后进行无菌灌装，得到液体制剂；菌浓检测方法为：取10g发酵液进行离心，3000rpm离心10min后弃去上清液，剩余物除以发酵液重量10g，取百分数，即得菌浓，为相对菌体浓度。B哈茨木霉固体制剂制备工艺为：哈茨木霉液体发酵结束后，发酵液菌浓为50％以上，pH为4.5～5.5，进行板框过滤，过滤后菌丝体在35～45℃风干后制成固体颗粒剂，加入浓度为0.1～1％w/v的淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素常用粘结剂中的一种或几种的组合，粘结剂溶液所用重量为颗粒剂预期总重量的1～3％，充分混合均匀；上述混合均匀的固体发酵载体中加入中药粉、米糠粉、麸皮粉、白炭黑、膨润土、硅藻土、轻质碳酸钙常用包衣剂中一种或几种的组合，其中中药粉为液体发酵时使用中药浸出液后剩余的的中药渣干燥粉碎物，包衣剂重量占颗粒剂预期制备总重量的10～90％，充分混合均匀，50℃以下烘干后包装，得哈茨木霉颗粒剂。为了更好的实现本专利技术，进一步的，液体发酵为碳源添加量为2％的玉米粉和麸皮粉中的一种；氮源添加量为2％的黄豆粉和葡萄酒皮渣粉中的一种；微量元素添加量为1.4％的硫酸镁、硝酸钙、硫酸亚铁中的一种或几种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。为了更好的实现本专利技术，进一步的，甘草和板蓝根浸出液制备方法为：称取甘草和板蓝根后，加入三倍重量的水进行煎煮，煮沸25～40min后进行过滤，得到的滤液即为中药浸出液。有益效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上进行培养；/n步骤二、种子液培养，将步骤一培养好的斜面菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养；/n步骤三、液体发酵，将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；/n步骤四、制剂制备，将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成液体制剂或固体制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉液体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、斜面培养，将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上进行培养；
步骤二、种子液培养，将步骤一培养好的斜面菌种接种到灭菌的种子培养基中进行培养；
步骤三、液体发酵，将步骤二培养好的种子液接种到灭菌的液体发酵培养基中进行培养，得到哈茨木霉发酵物；
步骤四、制剂制备，将步骤三发酵结束的液体发酵液制备成液体制剂或固体制剂。


2.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤一中PDA培养基制作方法为：
1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；
2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；
3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。


3.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤一斜面培养条件为黑暗条件下，25～28℃培养5～7d。


4.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤二中种子培养基为蔗糖15～20g/L，酵母粉3～6g/L，NaCl0.01～0.05g/L，FeSO4·7H2O0.1～0.3g/L，MgSO4·7H2O1.2～1.5g/L，KH2PO43.5～4.5g/L，NaNO36.5～7.0g/L；培养基湿热灭菌条件为121℃，25～30min；接种量为1～2cm2斜面孢子；培养条件为黑暗条件下在摇床25～28℃培养3～6d，摇床转速180～220rpm。


5.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉的液体发酵方法，其特征在于，步骤三中液体发酵培养基为碳源添加量为2％的小麦粉、玉米粉、马铃薯全粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉和麸皮粉中的一种或几种；氮源添加量为2％的黄豆粉、葡萄酒皮渣粉、硝酸铵、尿素、硫酸铵和硝酸钠中的一种或几种；其他微量元素添加量为1.4％的硫酸镁、硝...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜刚，郭成瑾，沈瑞清，焦杨，张丽荣，杨波，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院植物保护研究所宁夏植物病虫害防治重点实验室，河西学院，
类型：发明
国别省市：宁夏;64